詳細介紹
細胞培養(yǎng)的優(yōu)點:
1.研究的對象是活細胞
在實驗過程中,,根據要求可始終保持細胞活力,,并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況,,包括活細胞的形態(tài),、結構、生命活動等,。
2.研究條件可以人為控制pH,、溫度、氧氣,、二氧化碳,、張力等物理化學的條件,可以根據實際進行人為的控制,,同時,,可以施加化學、物理,、生物等因素作為條件而進行實驗觀察,,這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。
3.研究的樣本可以達到比較均一性通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后,,所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞,,需要時,可采用克隆化等方法使細胞達到純化,。
4.研究內容便于觀察,、檢測和記錄采用各種研究技術:如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡,、電子顯微鏡,、流式細胞術、激光共焦顯微鏡,、免疫組織化學,、原位雜交、同位素標記等各種儀器設備 記錄方式可采用攝影照片,、縮時電影,、電視等多種手段。
5.研究的范圍比較廣泛應用的學科領域較為寬廣,,如細胞學,、免疫學、腫瘤學,、生物化學,、遺傳學,、分子生物學等; 適用的對象范圍廣,,從低等動物到高等動物,,一種動物的不同年齡階段以及不同組織,都可進行有針對性的研究,。
6.研究的費用相對較經濟可提供大量,、同一時期、重復性好的,、生物學性狀相似的實驗對象,。
角膜組織是是位于眼球前壁的一層透明膜,為眼睛提供大部分屈光力,。公司科技提供來自新鮮或冷凍大鼠角膜組織中高質量的總RNA,PCR準備的條cDNA鏈,,蛋白質及其亞組分,。所有的產品在發(fā)貨之前均經過嚴格的QA/QC流程以確保其質量。這些產品可以直接用于基因克隆,,表達圖譜分析以及各種分子生物學實驗的研究,。
總RNA制備:利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA,然后用Qiagen RNA Clean Kit進行純化,。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度,、總含量、電泳照片,、OD值測定結果等,。
cDNA制備:純化后的總RNA來合成cDNA鏈,以50ul總反應體系進行逆轉錄,,體系中包括MMLV反轉錄酶和隨機引物以及10mg總RNA,。68℃反應10min 后終止RT反應。利用1x RT Buffer 運輸cDNA,,1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應,。所有cDNA產品在訂單發(fā)貨之前都經過了嚴格的QA/QC分析,保證了產品的質量,。
蛋白制備:利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備大鼠角膜組織裂解液,,離心去除組織碎片,通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,,組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF,,-80度保存。
潛在的應用: <1>已知基因的PCR克??;<2>mRNA選擇性剪接,;<3>基因克隆與目標測序;<4> Western and Northern Blot,;<5>蛋白檢測與蛋白質組學,;<6>芯片研究與表達圖譜。
產品名稱 | |
英文名稱 | Eye: Normal Rat Corneal Derivatives |
貨號 | CS-X4015 |
培養(yǎng)步驟:
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備:
1)準備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號11095-080),,85%,;北美胎牛血清(United States,GIBCO,,貨號16000-044),,15%。
2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,,95%,;二氧化碳,5%,。 溫度:37攝氏度,,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液:90%*培養(yǎng)基,,10%DMSO,,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存,。
二.細胞處理:
1)復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,,棄去上清液,,補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或將細胞懸液加入10cm皿中,,加入約8ml培養(yǎng)基,,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并檢查細胞密度,。
2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,,即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞,,傳代可參考以下方法:
1.棄去培養(yǎng)上清,,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,,若細胞大部分變圓并脫落,,迅速拿回操作臺,,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,,輕輕打勻后吸出,,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。
4.將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細胞凍存:待細胞生長狀態(tài)良好時,,可進行細胞凍存,。貼壁細胞凍存時,棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,,細胞變圓脫落后,,加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,再添加10%DMSO后進行凍存,。
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細胞分類:
一種:
是凍存產品,,由氮直液接拿出,干冰運輸給客戶,。一般不推薦這種,,也較少使用這種方式,因為復蘇手法對于細胞狀態(tài)影響較大,,一旦細胞狀態(tài)不好,,很難說是細胞自身不行,還是復蘇沒操作好,;另外溫度對細胞,、基因功能狀態(tài)影響很大,也不是細胞儲存的方式,,快遞時間也很難控制,,多種因素影響產品的質量;干冰運輸需要額外添加400元的運費(順豐),。
第二種:
是我們復蘇好細胞,,QC通過后,T-25灌滿培養(yǎng)基常溫運輸給客戶,,排除復蘇造成影響,,常溫運輸也對細胞影響也不大,只需加25元運費(順豐),。
質量保證:我們的細胞株來源于ATCC,、ECACC,、DSMZ、JCRB等,,購買到貨后,,由我們實驗室擴增、凍存,,凍存的產品全部經過QC檢測,,進口來源,保證5代以內,,活力>95%,,無細菌、真菌,、支原體污染,。