大豆源性成分探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序,；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度,；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù),；5．PCR 反應(yīng)液的配制,；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué),；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

產(chǎn)品名稱	大豆源性成分探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒
英文名稱	詳見說明書
貨號(hào)	CP934904

儲(chǔ)存條件：

14℃或－20℃樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后,，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清,。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清,。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝,，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

探針法：
大豆源性成分探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針,，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì),。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端,，而淬滅劑則在3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí),，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅,。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí),，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離,。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加,，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系,。相對(duì)于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性,。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA,。注意：DNA純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素,。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測(cè)靈敏度,。
二,、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線（以10-10E6這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對(duì)照,，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對(duì)照,。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6,，5,，4，3,，2和1號(hào),。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）,。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL,，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）,。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照,。
5. 換槍頭,，從6號(hào)管中取5 μL溶液到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘,，得10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照,。
6. 換槍頭,，從5號(hào)管中取5 μL溶液到4號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照,。
7. NC管中不加任何陽性對(duì)照,。
8. 從1-6號(hào)管中分別取5 μL和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步），每個(gè)樣品做3次重復(fù),。PCR后得到每個(gè)陽性對(duì)照稀釋樣品的熒光PCR Ct值,，并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應(yīng)用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容,。,。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）,。
稀釋陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,，只提供可以直接使用的長(zhǎng)為 86bp 的 DN段作為陽性對(duì)照,。
2.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）,。
4.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘,，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,。放冰上待用。5.換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,。放冰上待用,。
6.換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,。放冰上待用。
7.換槍頭,，在 4 號(hào)管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 4 號(hào)管中,，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照,。放冰上待用,。設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20  μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分,。
以下是公司正在銷售的產(chǎn)品：

Mouse Anti-Goat IgG/Cy5  Cy5標(biāo)記的小鼠抗羊IgG慶大霉素瓊脂基礎(chǔ)添加

Mouse Anti-Goat IgG/Cy3  Cy3標(biāo)記的小鼠抗羊IgG培養(yǎng)基

Mouse Anti-Goat IgG/Bio  生物素標(biāo)記的小鼠抗羊IgGCIN-1 培養(yǎng)基基礎(chǔ)添加

Mouse Anti-Goat IgG/APC  APC標(biāo)記的小鼠抗羊IgG處理液

Mouse Anti-Goat IgG/AP  性酸酶（AP）標(biāo)記的小鼠抗羊IgGITC 肉湯基礎(chǔ)添加

Mouse Anti-Goat IgG/Alexa Fluor 647  Alexa Fluor 647標(biāo)記的小鼠抗羊IgGBolton 肉湯基礎(chǔ)添加

Mouse Anti-Goat IgG/Alexa Fluor 555  Alexa Fluor 555標(biāo)記的小鼠抗羊IgG彎曲菌分離瓊脂添加  (頭孢哌酮,、兩性霉素 B、利福平）

Mouse Anti-Goat IgG/Alexa Fluor 488  Alexa Fluor 488標(biāo)記的小鼠抗羊IgGFBP 溶液

Mouse Anti-Goat IgG/Alexa Fluor 350  Alexa Fluor 350標(biāo)記的小鼠抗羊IgGCampy-Cefex  瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)添加

Mouse anti-Goat IgG ascites  小鼠抗羊IgG腹水

Mouse Anti-Goat IgG  小鼠抗羊IgG

大豆源性成分探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒Mouse anti-Bovine IgG ascites  小鼠抗牛IgG腹水標(biāo)準(zhǔn)品

Mouse Anti-Bov IgG/RBITC  羅丹明標(biāo)記的小鼠抗牛IgG1,2,3,4,6-O-五沒

Mouse Anti-Bov IgG/PE-Cy7  PE-Cy7標(biāo)記的小鼠抗牛IgG衛(wèi)矛醇

Mouse Anti-Bov IgG/PE-Cy5.5  PE-Cy5.5標(biāo)記的小鼠抗牛IgG五味子酚霍亂弧菌恒溫核酸檢測(cè)試盒二替康

單核細(xì)胞增生李斯特菌恒溫核酸檢測(cè)試盒二基姜黃素

大腸埃希菌O157：H7恒溫核酸檢測(cè)試盒二咖酰菊苣酸

志賀菌恒溫核酸檢測(cè)試盒二酸鈉

蠟樣芽胞桿菌恒溫核酸檢測(cè)試盒二羥茶E

阪崎腸桿菌恒溫核酸檢測(cè)試盒二草莓酸

對(duì)蝦黃頭?。╕HV）RNA恒溫核酸檢測(cè)試盒（不含提?。┒⑼狪

副溶血性弧菌恒溫核酸檢測(cè)試盒二膽固醇

沙門菌恒溫核酸檢測(cè)試盒二膽固醇

蝦肝胰腺細(xì)小病（HPV）DNA恒溫核酸檢測(cè)試盒（不含提?。┒S連