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大鼠晶狀體上皮細(xì)胞提取物培養(yǎng)步驟
閱讀:869 發(fā)布時間:2024-7-25大鼠晶狀體上皮細(xì)胞提取物培養(yǎng)步驟:
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:
1)準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號11095-080),85%;北美胎牛血清(United States,GIBCO,,貨號16000-044),15%,。
2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,,95%;二氧化碳,,5%,。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。
3)凍存液:90%*培養(yǎng)基,,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配,。液氮儲存,。
二.細(xì)胞處理:
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中,,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜),。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。
對于貼壁細(xì)胞,,傳代可參考以下方法:
1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,,在1000RPM條件下離心4分鐘,,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。
4.將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。貼壁細(xì)胞凍存時,,棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,細(xì)胞變圓脫落后,,加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,,再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。