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技術(shù)文章

大鼠晶狀體上皮細胞提取物培養(yǎng)步驟

閱讀:868          發(fā)布時間:2024-7-25

大鼠晶狀體上皮細胞提取物培養(yǎng)步驟:

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備:

1)準備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號11095-080),,85%;北美胎牛血清(United States,,GIBCO,,貨號16000-044),15%,。

2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,,95%;二氧化碳,,5%,。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3)凍存液:90%*培養(yǎng)基,,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配,。液氮儲存,。

二.細胞處理:

1)復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,,棄去上清液,,補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中,,加入約8ml培養(yǎng)基,,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并檢查細胞密度,。

2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,,即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞,,傳代可參考以下方法:

1.棄去培養(yǎng)上清,,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,,若細胞大部分變圓并脫落,,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,,棄去上清液,,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3)細胞凍存:待細胞生長狀態(tài)良好時,,可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時,,棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,,細胞變圓脫落后,加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,,再添加10%DMSO后進行凍存,。


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