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蛋白酶抑制劑混合物(用于哺乳動物)操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅,。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞,，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次,。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,，不取決于細(xì)胞數(shù),。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞,，每5-10×106動物,、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol,，反復(fù)吸打,。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理,。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘,，使核酸蛋白復(fù)合物*分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì),，脂肪,，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘,，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜,，多糖,，高分子量DNA，上清中含有RNA,。處理脂肪組織時,，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作,。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘,。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘,。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層,。RNA主要在水相中,，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中,，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相,，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA,。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,，室溫放置10分鐘。

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