原理簡介：

　原位雜交技術(shù)（in situhybridization）是以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異核酸分子的技術(shù),。使含有特異序列,、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈即探針，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交,，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進(jìn)行探測,，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

可以檢測cRNA,、miRNA,、LnRNA、DNA?？梢愿鞣N種屬的標(biāo)本,，包括哺乳動物、爬行動物,、菌,、植物標(biāo)本。也可以檢測組織芯片,。

注：為了提高檢測的成功率,，請在取材前跟公司業(yè)務(wù)員聯(lián)系，確認(rèn)取材,、固定,、包埋要注意的事項。

樣品保存：
RNA 保存：
RNase 酶的存在使 RNA 保存變得困難,。此酶廣泛存在于玻璃器皿上,、試劑中以及操作人員身上及衣服上。RNase 可迅速破壞細(xì)胞中的 RNA 及 RNA 探針本身,，因此用戶的實驗過程,、手套和溶液需要保證無菌，防止探針或組織 RNA 受到 RNase 的污染,。

冷凍切片的一般樣品保存：
為了使保存的載片獲得較好結(jié)果,，請勿將載片在室溫環(huán)境下干燥保存。正確方法是,，將其置于 100% 乙醇中-20 °C 保存,，或?qū)⑵溆蒙瘋惏b膜覆蓋的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C條件下保存。這種保存方法可使載片保存數(shù)年,。

探針選擇：

RNA 探針：

RNA 探針長約 250–1500bp,；長度為800bp左右的探針具有較好靈敏度和特異性。轉(zhuǎn)錄模板應(yīng)支持探針（反義鏈）和陰性對照（正義鏈）RNA 的轉(zhuǎn)錄,。將轉(zhuǎn)錄模板克隆至包含對生啟動子的載體可實現(xiàn)這一目的。制備探針之前,，必須對環(huán)狀模板進(jìn)行線性化,，但也可使用 PCR 模板。

DNA 探針：

DNA 探針為原位雜交提供較高的靈敏度,。與RNA探針相比,，DNA探針與靶mRNA 分子的雜交強(qiáng)度較弱，因此在雜交后的洗滌中不應(yīng)使用甲醛,。

探針特異性至關(guān)重要,。如果已知細(xì)胞中mRNA或DNA的確切核苷酸序列，則可據(jù)此設(shè)計高度精確的互補(bǔ)探針,。如果超過 5% 的堿基對不互補(bǔ),，那么探針只能與靶序列發(fā)生輕度雜交,。這意味著，探針更容易在洗滌和檢測步驟中被洗去,，可能無法正確檢測,。

實驗方案舉例：
(DIG)標(biāo)記RNA探針原位雜交實驗方案

此方案介紹了如何使用DIG標(biāo)記的RNA單鏈探針來檢測石蠟包埋切片中目標(biāo)基因的表達(dá)情況。

1) 脫蠟

如為冷凍切片請從第 2 步開始操作,。

如為甲醛固定的石蠟包埋切片,，請繼續(xù)此步驟。

首先,，對載片進(jìn)行脫蠟和復(fù)水操作,。如果石蠟去除不*，則會導(dǎo)致切片的染色效果較差,。

將載片置于支架上,，然后執(zhí)行以下洗滌操作：

二甲苯：2x3 分鐘

1:1 的二甲苯和100%乙醇：3 分鐘

100%乙醇：2x3 分鐘

95%乙醇：3 分鐘

70%乙醇：3 分鐘

50%乙醇：3 分鐘

使用冰冷的自來水清洗

抗原修復(fù)步驟之前將載片置于自來水中。從這一步開始,，不能使載片干燥,，因為干燥會導(dǎo)致非特異性抗體結(jié)合和高背景染色。

2) 抗原修復(fù)

將含20 µg/mL蛋白酶K的50mM Tris預(yù)熱并在37 °C條件下孵育酶解10–20分鐘,。孵育時間和蛋白酶 K 的濃度可能需要根據(jù)實際情況優(yōu)化,。

我們建議通過蛋白酶 K 滴定實驗來確定合適條件。酶解不充分會導(dǎo)致雜交信號降低,，過度酶解會影響組織形態(tài),，給雜交信號的定位帶來極大困難。蛋白酶 K 的合適濃度會隨組織類型,、固定時間和組織大小而發(fā)生變化,。

3) 使用蒸餾水清洗載片5次。
4) 將載片浸入預(yù)冷的20% (v/v) 乙酸中20秒,。這樣可使細(xì)胞通透化,，使探針或抗體能夠透過。
5) 分別使用70%乙醇,、95%乙醇和100%乙醇洗滌載片（每次約1分鐘）使其脫水,，然后風(fēng)干。
6) 向每個載片中加入 100 µL 雜交液,。

鹽溶液 (20x)

4 M NaCl

100 mM EDTA

200 mM Tris-HCl pH 7.5

100 mM NaH2PO4.2H2O

100 mM NaH2PO4.2H2O

丹哈德溶液 (100x)

10 g聚蔗糖

10 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）

10 g 牛血清白蛋白 (BSA)

500 ml無菌 dH2O

7) 將載片置于所需雜交溫度下的增濕雜交盒中孵育1 小時,。雜交溫度的范圍通常為 55–62 °C。
8) 在PCR 管中用雜交液稀釋探針,。利用PCR儀在95 °C條件下加熱RNA 或DNA 2分鐘,，使其變性。然后立即將探針置于冰上冷卻，以防止重退火,。
9) 除去雜交液,。向每個切片加入50–100μl探針稀釋液，覆蓋整個樣品,。在 65 °C 條件下在增濕的雜交盒中孵育過夜,。用蓋玻片蓋住樣品，以防樣品蒸發(fā),。

在此步驟中,，RNA 探針會與相應(yīng)的mRNA雜交，或DNA探針會與相應(yīng)的細(xì)胞DNA雜交,。雜交溫度的優(yōu)化取決于所用的探針序列以及細(xì)胞或組織類型,。所分析的每種組織類型都需進(jìn)行雜交溫度的優(yōu)化。

探針的比較合適雜交溫度取決于靶序列中堿基的百分比含量,。序列中胞嘧啶和鳥嘌呤的比例是關(guān)鍵因素,。

10) 嚴(yán)格洗滌

通過調(diào)節(jié)溫度、鹽濃度和洗滌劑濃度等溶液參數(shù)可消除非特異性相互作用,。

配制 1 L 20x 檸檬酸鈉緩沖液 (SSC)

175.3 g 氯化鈉 (3 M)

88.2 g 檸檬酸鈉

800 mL 無菌水

使用檸檬酸將 pH 調(diào)節(jié)為5,，定容至1 L 并使用高壓滅菌器進(jìn)行滅菌處理
洗滌 1

50% 甲酰胺的 2x SSC

3x5 分鐘，37-45 ℃

在較高溫度（高達(dá) 65° C）下短時間洗滌,，洗去多余的探針和雜交緩沖液,。如果洗滌時間過長，則會洗掉大量的雜交探針 RNA/DNA,。

洗滌 2

  0.1–2x SSC

  3x5 分鐘,，25-75 ℃

此步驟會消除非特異性和/或重復(fù)性 DNA/RNA 雜交。

按照以下說明對嚴(yán)謹(jǐn)洗滌的溫度和鹽濃度進(jìn)行優(yōu)化：

· 對于極短的DNA/RNA 探針 (0.5–3 kb) 或極為復(fù)雜的探針,，洗滌溫度應(yīng)更低（zui高45 °C）且嚴(yán)格度更弱 (1–2xSSC),。

· 對于單基因座或較大的探針，溫度應(yīng)在65 °C 左右且嚴(yán)格度應(yīng)較強(qiáng)（低于0.5x SSC）,。

· 對于重復(fù)性探針,，溫度應(yīng)達(dá)到zui高且嚴(yán)格度應(yīng)達(dá)到頂點（例如 α-衛(wèi)星重復(fù)序列）。

11) 在室溫下使用 MABT（含 Tween20 的馬來酸緩沖液）洗滌兩次,，每次30分鐘,。MABT 的性質(zhì)比PBS 更溫和，更適用于核酸檢測,。

配制 5x MABT 母液

   58 g 馬來酸

   43.5 g NaCl

   55 g Tween-20

   900 mL 水

添加三羥甲基氨基甲烷，將 pH 調(diào)節(jié)至 7.5,。大約需要 100 g 三羥甲基氨基甲烷,。定容至 1 L。

12) 烘干載片。
13) 將其轉(zhuǎn)移至增濕盒中,，向每個切片加入 200 µL 封閉緩沖液（MABT + 2% BSA,，牛奶或血清）。在室溫下封閉 1–2 小時,。
14) 去除封閉緩沖液,。將抗標(biāo)記抗體以所需稀釋度加入封閉緩沖液。查看抗體說明書中推薦的濃度/稀釋度,。在室溫下孵育 1–2 小時,。
15) 在室溫下使用 MABT 洗滌載片 5 次，每次 10 分鐘,。
16) 在室溫下使用預(yù)染色緩沖液（100 mM Tris pH9.5,，100 mM NaCl，10 mM MgCl2）洗滌載片 2 次,，每次 10 分鐘,。
17) 如需進(jìn)行熒光檢測，請?zhí)恋?18 步,。對于其他形式的檢測,，請將載片放回增濕盒中，然后依照廠家說明書(如有說明書的話)使其顯色,。

18) 使用蒸餾水清洗載片,。
19) 將載片風(fēng)干 30 分鐘。然后使用 100% 乙醇進(jìn)行洗滌,，并將其*風(fēng)干,。
20) 使用 DePeX 封片溶液進(jìn)行封片。