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原代細(xì)胞分離

一,、細(xì)胞培養(yǎng)

1取材 在無(wú)菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過(guò)的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中,，這一過(guò)程稱為取材,。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無(wú)取材這一過(guò)程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng),。

2培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過(guò)程稱為培養(yǎng),。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株,，要將細(xì)胞凍存,。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基,，以的冷卻速度凍存,，終保存于液氮中。在極低的溫度下,，細(xì)胞保存的時(shí)間是無(wú)限的,。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后,，立即放入37℃水中,，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng),。

二,、原代細(xì)胞分離

凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血,，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞,。1懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來(lái)自血液、羊水,、胸水或腹水的懸液材料,，簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層,，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞,。2實(shí)體組織材料的分離方法對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,，為了使組織中的細(xì)胞充分分散,，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法,。

三,、細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)

目前主要有兩種用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法,，通過(guò)直接測(cè)定進(jìn)行分裂

的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力,。另一種是間接的方法,，即細(xì)胞活力（cell viability）檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力,。顯然,，細(xì)胞活力檢測(cè)法并不能證明檢測(cè)樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會(huì)自發(fā)啟動(dòng)凋亡程序,，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生,；這時(shí)若采用細(xì)胞活力檢測(cè)法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量,，但我們并不能從藥物干擾組細(xì)胞數(shù)大于對(duì)照組的事實(shí)說(shuō)明藥物可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論,。所以直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

其中常見(jiàn)檢測(cè)：CCK8檢測(cè)法 ,，MTT檢測(cè)法,，Brdu檢測(cè)法，Edu檢測(cè)法,，平板克隆形成,。

四、細(xì)胞周期檢測(cè)技術(shù)

細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程,，所需的時(shí)間叫細(xì)胞周期時(shí)間,。

常用的方法：流式檢測(cè)細(xì)胞周期，標(biāo)記有絲分裂百分率法,。

五,、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

常見(jiàn)檢測(cè)方法：流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位,，活性氧檢測(cè),，Hoechst染色，電鏡,，TUNEL。

六,、細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測(cè)

常見(jiàn)檢測(cè)方法：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),，Transwell實(shí)驗(yàn)，Invasion實(shí)驗(yàn)

七,、其他實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞惡性程度：軟瓊脂實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞屏障：跨膜電阻,、熒光黃透過(guò)率

細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)