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服務(wù)介紹

1)技術(shù)原理:

冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片,。它實(shí)際上是以水為包埋劑,，將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的。在冰凍切片前組織不經(jīng)過(guò)化學(xué)藥品處理或加熱過(guò)程,，大大縮短了制片時(shí)間,。同時(shí)，由于此法不需要經(jīng)過(guò)脫水,、透明和浸蠟等步驟,，因而較適合于脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片,，并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床診斷

冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片,。它實(shí)際上是以水為包埋劑，將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的,。在冰凍切片前組織不經(jīng)過(guò)化學(xué)藥品處理或加熱過(guò)程,，大大縮短了制片時(shí)間。同時(shí),，由于此法不需要經(jīng)過(guò)脫水,、透明和浸蠟等步驟，因而較適合于脂肪,、神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片,，并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床診斷,。

1. 取材：  應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料,，防止組織發(fā)生死后變化。

2. 速凍：  為了較好地保存細(xì)胞內(nèi)的酶活性或盡快制成切片標(biāo)本的需   要,，一般在取材后就要立刻對(duì)組織塊進(jìn)行速凍,，使組織溫度驟降，縮短降溫的時(shí)間,，減少冰晶的形成,。  液氮速凍切片法是實(shí)驗(yàn)室常用的速凍切片方法。具體做法是將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）,，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織,，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v,，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中,，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。在制成凍塊后,，即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片,。若需要保存，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包,，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/span>

3．固定：  樣品托上涂一層OCT包埋膠,，將速凍組織置于其上,，4℃冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組織。  取下組織置于錫箔或者玻片上,，樣品托速凍,。  組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠,，以覆蓋為宜,，速凍架（PE）上30min。

切片：  恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī),，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi),，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10μm,。切片時(shí),，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～-20℃為宜，溫度過(guò)低組織易破碎,，抗卷板的位置及角度要適當(dāng),，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng),。切好室溫放置30min后,，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min,。PBS洗5min×3,。進(jìn)行抗原熱修復(fù)，微波熱修復(fù)也可,，室溫自然冷卻,。可用3%H2O2孵育5~10min,，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,。

5．**熒光染色：

冰凍切片室溫晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1 小時(shí)（此步可不洗）

滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液(抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面,，且整個(gè)過(guò)程中不會(huì)使組織干涸),，將切片放在加了PBS的**組化濕盒，室溫孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜,。

第二天先將濕盒放到37℃回溫1h,，然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗,。

滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37℃孵育1 小時(shí),。  回收二抗，切片置于染缸內(nèi),，PBS洗5min×3次,。

滴加DAPI工作液染核,，室溫10-20min(工作濃度0.1%染色15min)。

回收DAPI,滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹(shù)膠,，用處理干凈的蓋玻片封片,，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。做好的片放在切片盒內(nèi),，置于4℃冰箱,，可保存一周左右。