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1、差速離心法
差速離心(differential centrifugation)是指在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心,,用于分離不同大小的細胞和細胞器(圖1)。在差速離心中細胞器沉降的順序依次為:核,、線粒體,、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、后為核蛋白體,。由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊,而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中,,一般重復2~3 次效果會好一些,。差速離心只用于分離大小懸殊的細胞,更多用于分離細胞器,。通過差速離心可將細胞器初步分離,常需進一步通過密度梯離心再行分離純化,。
2,、密度梯度離心
密度梯度離心(density gradient centrifugation)是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,,將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,,通過重力或離心力場的作用使細胞分層,、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種,。
密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫,,蔗糖和多聚蔗糖。分離活細胞的介質(zhì)要求:1)能產(chǎn)生密度梯度,,且密度高時,,粘度不高,;2)PH中性或易調(diào)為中性,;3)濃度大時滲透壓不大;4)對細胞無毒,。
2.1 速度沉降
速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器,。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低,介質(zhì)的大密度應小于被分離生物
顆粒的小密度,。生物顆粒(細胞或細器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離,。
2.2 等密度沉降
等密度沉降(isopycnic sedimentation)適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮
到與自身密度相等的介質(zhì)處,,并停留在那里達到平衡,,從而將不同密度的細胞或細胞器分離。等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進行,。介質(zhì)的*高密度應大于被分離組分的大密度,,而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度,不能太平緩,。再者,,這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100 倍,,故往往需要高速或超速離心,離心時間也較長,。大的離心力,、長的離心時間都對細胞不利。大細胞比小細胞更易受高離心力的損傷,,而且停留在等密度介質(zhì)中的細胞比處在移動中的細胞受到更大的損傷,。因此,這種方法適于分離細胞器,,而不太適于分離和純化細胞,。
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