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產(chǎn)品說明:
Fluo-4是一種將Fluo-3結(jié)構(gòu)中的Cl替換成F的鈣熒光探針。由于將CI替換成了電子吸引力更強的F,它的大激發(fā)波長會向短波長處偏離10nm左右,。這個波長更接近于氬激光器的波長,，所以用氬激光器激發(fā)時,，F(xiàn)luo-4 的熒光強度比Fluo-3強一倍。Fluo-4,AM穿透細胞膜進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-4,，從而被滯留在細胞內(nèi),，F(xiàn)luo-4若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與細胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強的熒光,，大激發(fā)波長為494nm,，大發(fā)射波長為516nm?？梢允褂眉す夤簿劢癸@微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,。
操作說明:
1.向Fluo-4,AM/DMSO溶液中加入等體積的20%的Pluronic F127溶液，Pluronic F127可以防止Fluo-4,AM在HBSS中聚合并能夠幫助其進入細胞,。
注意:不建議在Pluronic FI27中*保存Fluo-4,AM溶液,。Pluronic F127的量可以適當調(diào)整。PluronicF127和Fluo4,AM一定要確保*溶解后才可使用,。.
2.用HBSS稀釋Fluo-4, AM溶液,，制備4-5μM的Fluo-4, AM工作液。
注意:為了避免過度加載造成細胞毒性,，建議在取得有效結(jié)果的基礎上盡量使用低探針濃度,。
3.將Fluo-4, AM工作液加入細胞，在37C培養(yǎng)20分鐘,。
4.加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS,再繼續(xù)培養(yǎng)40分鐘,。
5. 用HEPES buffer saline洗滌細胞3次，然后用HEPES bffer saline使細胞重懸浮,，制成1X 10>
cells/mL的溶液,。
6. 37C下培養(yǎng)10分鐘，然后用該細胞進行熒光鈣離子檢測,。激發(fā)波長506nm,， 發(fā)射波長526nm。
*標記的條件因細胞種類而異,，在每次實驗前,，請先確定條件。以上方法僅供參考,。
注意事項:
1,、如果使用含有血清的培養(yǎng)基，血清中的脂酶會分解AM體,，從而降低Fluo-4,AM進入細胞的效果,。另外，含有酚紅的培養(yǎng)基會使本底值略微偏高,，所以加工作液之前,，應該盡量去除培養(yǎng)基殘留,。
2、熒光染料均存在萃滅問題,，請注意避光,，以減緩熒光萃滅。