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細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定背景與原理:
生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)的常用方法,也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo),是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后,經(jīng)過短暫的懸浮后貼壁, 隨后渡過長(zhǎng)短不同的潛伏期,即進(jìn)入快速生長(zhǎng)的指數(shù)生*,。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后,停止生長(zhǎng),進(jìn)入平臺(tái)期,然后退化衰亡,。為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過程中細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化,需連續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通常計(jì)數(shù)6天,。為準(zhǔn)確起見,一般每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行重復(fù),。
材料、試劑與儀器
1,、實(shí)驗(yàn)材料:
Hela細(xì)胞系,。
2、實(shí)驗(yàn)試劑:
DMEM培養(yǎng)基(青霉素,鏈霉素 , 10%血清, 0.25%胰蛋白酶溶液,，臺(tái)酚藍(lán)染液,。
3,、實(shí)驗(yàn)儀器:
超凈工作臺(tái), co2培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,微量移液器,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,培養(yǎng)瓶,離心管，移液管,廢液缸,蓋玻片,，24孔板,。
方法與步驟
1、取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞,用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù),。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按5x104/mL作傳代培養(yǎng)接種于24孔板中,共接種21孔細(xì)胞,。1 m/孔。余下三孔可設(shè)傳代培養(yǎng)的對(duì)照,。
2,、24h后每天記錄細(xì)胞數(shù)目,每次取3孔細(xì)胞,分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算平均值,。連續(xù)計(jì)數(shù)7d,。細(xì)胞用胰酶消化后加入一定量的培養(yǎng)基混勻制成細(xì)胞懸液。取少量懸液與臺(tái)酚藍(lán)1:1混臺(tái),。取一干凈的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,蓋上蓋片,從蓋片兩邊滴入細(xì)胞懸液使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片之間,。注意滴液勿有氣泡,也不能太多，否則會(huì)使蓋片浮起而使細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn),。
3,、低倍鏡下觀察,活細(xì)胞不著色,臺(tái)盼藍(lán)著色的細(xì)胞呈深藍(lán)色,是不健康或已死亡的細(xì)胞,不能計(jì)數(shù)。
找出計(jì)數(shù)板上的方格,計(jì)算四角大格內(nèi)總細(xì)胞數(shù),大格線者只計(jì)左側(cè)和上方,不計(jì)右側(cè)和下方細(xì)胞懸液中細(xì)胞

密度計(jì)算公式為:細(xì)胞數(shù)mL= (四角大格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4) x104x2
4,、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果,以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)mL)為縱坐標(biāo),以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線,。