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一、服務(wù)介紹

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位,，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量,。

二,、實(shí)驗(yàn)原理

將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上,，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。

三、實(shí)驗(yàn)流程

免疫熒光單標(biāo)記方法

免疫熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子,，方法比較簡(jiǎn)單，只要按照染色步驟去做,，通常不存在太多的問題,。但要注意固定液的選擇,，固定液選擇的合適與否，可能會(huì)直接影響染色結(jié)果,。具體染色方法如下。

1,、所需材料與試劑

a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%-70%的細(xì)胞,。

b, 一抗,、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗,。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預(yù)冷20 min),。

d, 封閉液。

e, 0.01mol／LPBS緩沖液,。

2,、染色方法

a, 取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿,，用0.01MPBS洗2-3遍。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min,。

d，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min,，抑制IgG的非特異性結(jié)合,。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清,，直接加入一抗,，37℃孵育1 h或4℃過夜?？贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定),。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min,，0.3% TritonX 5 min,，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗,，37℃,，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain,，0.01 mol/LPBS洗5min,，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min,，用濾紙吸干,。

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察,，或于4℃避光保存,。

免疫熒光雙標(biāo)記方法

免疫熒光的雙標(biāo)記是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子，當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明,。此方法稍微復(fù)雜一些,，應(yīng)注意所用的一抗是來自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔,；B抗體為單克隆抗體,，來自小鼠)。其次,，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊,，且盡量遠(yuǎn)離,，通常可以選擇FITC和TRITC,、Alex488和TRITC,、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合,。通常情況下,，染色時(shí)兩種一抗可以同時(shí)孵育，然后可以同時(shí)孵育兩種二抗,。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí),，應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗,。其他步驟同免疫熒光單標(biāo)記。

四,、客戶提供

細(xì)胞株或細(xì)胞爬片,。注：細(xì)胞爬片不宜太密；細(xì)胞固定,。組織切片,，一抗

五、公司提供

基本實(shí)驗(yàn)步驟,、藥品,、樣品處理,、圖片及圖片分析，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

實(shí)驗(yàn)周期：1-3周