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原代細胞分離

一、細胞培養(yǎng)

1取材 在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定）,，經(jīng)過的處理（如消化分散細胞,、分離等）后接入培養(yǎng)器血中,，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程,。機體取出的組織細胞的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng),。

2培養(yǎng) 將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復蘇（可參閱后面有關章節(jié)）為了保存細胞,，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃,，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基,，以的冷卻速度凍存，終保存于液氮中,。在極低的溫度下,，細胞保存的時間是無限的。復蘇一般采用快融方法,，即從液氮中取出凍存管后,，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解,。然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng),。

二、原代細胞分離

凡是來源于胚胎,、組織器官及外周血,，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。1懸浮細胞的分離方法組織材料若來自血液,、羊水,、胸水或腹水的懸液材料，簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘,。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層,，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。2實體組織材料的分離方法對于實體組織材料,，由于細胞間結(jié)合緊密,，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液,，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法,。

三、細胞增殖檢測技術

目前主要有兩種用于檢測細胞增殖能力的方法,。一種是直接的方法，通過直接測定進行分裂

的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力,。另一種是間接的方法,，即細胞活力（cell viability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。顯然,，細胞活力檢測法并不能證明檢測樣品中的細胞是否在增殖,。如細胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生,；這時若采用細胞活力檢測法,，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細胞數(shù)大于對照組的事實說明藥物可促進細胞增殖的結(jié)論,。所以直接的證據(jù)應該采用方法一,。

其中常見檢測：CCK8檢測法 ，MTT檢測法,，Brdu檢測法,，Edu檢測法，平板克隆形成,。

四,、細胞周期檢測技術

細胞周期指由細胞分裂結(jié)束到下一次細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時間叫細胞周期時間,。

常用的方法：流式檢測細胞周期,，標記有絲分裂百分率法。

五,、細胞凋亡檢測

常見檢測方法：流式檢測細胞凋亡,，線粒體膜電位，活性氧檢測,，Hoechst染色,，電鏡，TUNEL,。

六,、細胞轉(zhuǎn)移能力檢測

常見檢測方法：細胞劃痕實驗，Transwell實驗,，Invasion實驗

七,、其他實驗

細胞惡性程度：軟瓊脂實驗

細胞屏障：跨膜電阻、熒光黃透過率

細胞粘附實驗

共培養(yǎng)實驗

裸鼠成瘤實驗