分子實驗-PCR

分子實驗-PCR實驗的原理是DNA分子在電場中會向正極方向移動,。不同長度的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同,，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開,。

　　1.試劑

　　PCR產(chǎn)物,，TAE電泳緩沖液，1000x溴化乙錠儲存液,，電泳級瓊脂糖,，DNA分子量標準

　　2.實驗準備

　　配制TAE電泳緩沖液(50x儲存液，pH約8.5: Tris 堿242g 57.1ml冰已酸,，37.2g Na2EDTA.2H2O,，dd water定容至lL)，6x加樣緩沖液(0.25%溴酚藍,，40%蔗糖水溶液) ; 1.5ml 離心管裝入鋁制飯|盒(滅菌),、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌)。

　　3.操作步驟

　　(1)稱取0.4g瓊脂糖粉,，放入三角瓶,，加入50ml TAE電泳緩沖液(1x)，放入微波爐中燒開( lmin),。注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末,，待*熔化后停止微波爐(切不可讓膠溶液溢出到微波爐中! )。

　　(2)戴上線手套,，從微波爐中取出三角瓶,，置桌面上冷卻致不燙手(約50-60°C)。

　　(3)把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液,。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相平即可,，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10-20分鐘待膠*凝固,。(剩下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用),。

　　(4)在水平電泳槽中加滿1xTAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V(10V/cm),，注意正負電極的位置連接正確,。

　　(5)待膠*凝固后( 15-20分鐘),，小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺上,，凝膠要沒入電泳液中,。凝膠上有樣品孔的側(cè)要朝向電泳槽的負極。

　　(6)在凝膠上選擇相鄰的加樣孔,。用10μl 的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔中(如果需要時,，在相鄰的加樣孔中加入1.5-3ul DNA分子量標準物)。

　　加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上,，用另一只手扶住這只手的手腕,，以減少移液器的抖動?？吹剿{色的樣品吸管尖頭伸進加樣孔后(不能伸得太深,，以免穿破凝膠的底部)緩緩將藍色的樣品壓入加樣孔中。切不可使藍色樣品流到孔外,。

　　(7)打開電源開關(guān),，樣品將形成條藍色的橫帶向前移動 (如果發(fā)現(xiàn)藍色向后移動，立即關(guān)閉電源,，調(diào)換電極)。電泳將進行約30min,。

　　(8)當藍色的溴酚藍遷移到距凝膠邊緣1cm時,，關(guān)閉電源。取出模具和凝膠,。放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照,。

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