01選擇熒光探針常用的熒光染料是DCFH-DA,，它能夠進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解成DCFH,。DCFH隨后可以被細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化,，生成發(fā)熒光的DCF,。

02DCFH-DA是一種用于檢測(cè)活性氧ROS的熒光探針,，全稱為2,7-二氯熒光素二乙酸酯。其工作原理為：DCFH-DA本身沒有熒光,，但可以自由穿過細(xì)胞膜,，一旦進(jìn)入細(xì)胞，它會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH,，由于DCFH無法穿過細(xì)胞膜,，因此熒光探針會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH,，生成有熒光的DCF,，且熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡,、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備,，在最大激發(fā)波長(zhǎng)480nm和最大發(fā)射波長(zhǎng)525nm下檢測(cè)熒光信號(hào)。

03步驟裝載探針

對(duì)于刺激時(shí)間較短(通常為2小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞,，先裝載探針,，后用活性氧陽性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)(通常為6小時(shí)以上)的細(xì)胞,，先用活性氧陽性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,，后裝載探針。

原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,，使終濃度為10微摩爾/升。去除細(xì)胞培養(yǎng)液,，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA,。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升,。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘,。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA,。通?；钚匝蹶栃詫?duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

收集細(xì)胞后裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,，使終濃度為10微摩爾/升,。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升,，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘,。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸,。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次,，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞,。通常活性氧陽性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平,。