一、分子克隆與質(zhì)粒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)服務(wù)介紹

分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA的片段的方法,。常含有目的基因,，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體,，通過(guò)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式,，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再?gòu)暮Y選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體,，可以得到插入DNA的許多拷貝,，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。

二,、分子克隆與質(zhì)粒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組,，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子,。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中,，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接,。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸桿菌連接酶沒(méi)有的特性,，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率,。

   T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復(fù)合物,；然后,，酶—AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化,；后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵,，把切口封起來(lái)。

   DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法,，為了防止載體本身的自連,，可以通過(guò)(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服。

   連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性.但是在這個(gè)溫度下,，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的,。因此人們找到了一個(gè)折中溫度，即12-16℃,，連接12-16h(過(guò)夜),，這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,。

三,、實(shí)驗(yàn)流程

目的DNA的擴(kuò)增和純化；

連接反應(yīng),；

電泳檢測(cè)連接產(chǎn)物,。

四、客戶提供

樣本DNA,，基因序列,，試劑盒。

五,、公司提供

構(gòu)建好的載體,，電泳膠圖，測(cè)序結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)周期：大約1-2月,。