一、服務(wù)介紹

　　免疫熒光實驗服務(wù)：細胞化學是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標本,，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量,。

　　二,、實驗原理

　　將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。

　　三、實驗流程

　　免疫熒光實驗服務(wù)單標記方法

　　單標記是指只標記一種蛋白質(zhì)分子,，方法比較簡單,，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題,。但要注意固定液的選擇,，固定液選擇的合適與否，可能會直接影響染色結(jié)果,。具體染色方法如下,。

　　1、所需材料與試劑

　　a,培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達到60%-70%的細胞,。

　　b,一抗,、FITC或TRITC標記的二抗。

　　c,4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(-20℃預冷20min),。

　　d,封閉液,。

　　e,0.01mol／LPBS緩沖液。

　　2、染色方法

　　a,取出培養(yǎng)有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿,，用0.01MPBS洗2-3遍,。

　　b,加入0.3%的Tritonx-100,37℃,30rain

　　c,加入4%多聚甲醛試問固定30min或冷丙酮4℃固定10min。

　　d,，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30min,，抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清,。

　　e,去掉正常血清,，直接加入一抗，37℃孵育1h或4℃過夜,?？贵w以0.01mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗而定)。

　　f,0.3%TritonX-100洗5min,，0.01mol/IPBS洗5min,，0.3%TritonX5min，0.01MPBS洗5rain,。

　　g,加入FITC-二抗或TRITC-二抗,，37℃，孵育1h,。

　　h,0.3%TritonX-100洗5rain,，0.01mol/LPBS洗5min，0.3%TritonX5min,，0.01mol/LPBS洗5min,，用濾紙吸干。

　　i,90%甘油(PBS配制)封片,。

　　j,激光掃描共焦顯微鏡下觀察,，或于4℃避光保存。

　　雙標記方法：是指同時標記細胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子,，當懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明,。此方法稍微復雜一些，應(yīng)注意所用的一抗是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體,，來自家兔,；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠),。其次,，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊,，且盡量遠離,，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC,、FITC和Cy5,，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下,，染色時兩種一抗可以同時孵育,，然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結(jié)果一種顏色非常弱,，而另一種顏色比較強時,，應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記,。

　　四,、客戶提供

　　細胞株或細胞爬片。注：細胞爬片不宜太密,；細胞固定,。組織切片，一抗

　　五,、公司提供

　　基本實驗步驟,、藥品、樣品處理,、圖片及圖片分析,，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

　　實驗周期：1-3周