一,、 人外周血單個核細胞（PBMC）的分離

1. 3ml抗凝血加入3ml 1×PBS進行稀釋,。

2. 在15ml離心管內(nèi)加入3ml淋巴細胞分離液,，再在液面上方平鋪3ml稀釋過的抗凝血,，常溫下,，水平離心機600g,，離心30min。

3. 吸取中間白膜層細胞,，加入15ml離心管中,，再加入10ml 1×PBS混勻，常溫下,，1000rpm,，離心10min，棄上清,，每管加入2ml MACS緩沖液重懸細胞并計數(shù),，調(diào)整細胞數(shù)量，每個樣本不超過107個細胞,。

4. 2000rpm,，離心3min，棄上清,。

二,、 磁珠分選

1. 每管加入40ul MACS緩沖液重懸細胞，再加入10ul CD4+T Cell Biotin-Antibody Cocktail, human,，混勻,，4℃孵育5min。

2. 每管加入30ul MACS緩沖液,，再加入20ul CD4+T Cell MicroBead Cocktail,human,，混勻,，4℃孵育10min。

3. 將分選柱置于磁力架上,，加入3ml MACS緩沖液潤洗柱子,，待液體不再流出，更換新的離心管,。

4. 將細胞懸液加入分選柱,，待液體不再流出，加入3ml MACS緩沖液洗柱子,，液體收集完畢,，將離心管撤離后，再將分選柱撤下,。

5. 將收集到的細胞懸液進行離心,，1500rpm,，5min,，去上清。

三,、流式鑒定