一,、背景
神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織,,如大腦皮層,、海馬,、脊髓等腦組織直接取出,,再接種培養(yǎng)的方法,。目前國內(nèi)、外有關神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多,,但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問題,。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細胞,相對于其它細胞而言,,神經(jīng)元在體外更難以存活和生長,。因此,體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營養(yǎng)條件均較為特殊,。
神經(jīng)細胞的體外培養(yǎng)技術是研究神經(jīng)源性疾病的發(fā)病機制,、進程的一個重要工具,能很好的,、直觀的反映離體神經(jīng)元的發(fā)育狀況和生理活性,,如何建立一個穩(wěn)定成熟的神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系是神經(jīng)系統(tǒng)疾病體外實驗研究順利進行的基礎,。隨著基礎醫(yī)學及臨床醫(yī)學研究的逐漸深入,神經(jīng)細胞的體外培養(yǎng)技術在腦損傷,、神經(jīng)障礙性疾病,、衰老相關神經(jīng)疾病方面得到廣泛重視和普及應用。
二,、實驗步驟
(1)75% (體積分數(shù))酒精消毒孕鼠,在無菌條件下取出胎鼠,分離并切取脊髓,置于冷的無鈣,、鎂的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)。
(2)解剖顯微鏡無菌條件下仔細剝離脊膜及血管,。
(3)用彈簧剪將脊髓剪成1cm3大小,,消化液37℃消化15-20min,每五分鐘振蕩一次,;
(4)去掉上清,,加入終止液終止消化,吹打10-15次,,不能有氣泡,,收集上清,剩余組織再消化一次,。
(5)4℃1000rpm離心10min,,棄上清,加入種植液1重懸,,培養(yǎng)箱內(nèi)差速貼壁30min,;
(6)收集上清,臺盼藍染色計數(shù),,按6*105cells/孔種入六孔板(種植液1),,37℃,5%CO2,,95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),;
(7)培養(yǎng)第二天,全換液更換為種植液2,;
(8)培養(yǎng)第四天,,半量換液加入5uM的阿糖胞苷,24h全量換液,;
(9)之后每周換液兩次,。
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