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《高效腸道屏障功能檢測(cè)方案：安捷倫Cytation＋艾瑋得器官芯片》
腸道作為人體消化系統(tǒng)的關(guān)鍵部分，其屏障功能宛如堅(jiān)固防線,，守護(hù)著機(jī)體健康,，既阻止有害物質(zhì)入侵，又維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,，這在藥物研發(fā),、毒理學(xué)研究等諸多生物醫(yī)藥領(lǐng)域至關(guān)重要。但傳統(tǒng)檢測(cè)方法受技術(shù)瓶頸制約,，在檢測(cè)效率及模擬真實(shí)生理環(huán)境方面表現(xiàn)欠佳,，難以滿足科研快速推進(jìn)的需求。
澤匯生物引入的安捷倫 Cytation 與艾瑋得器官芯片強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合,，將成像技術(shù)與類(lèi)器官模型結(jié)合,，整合成像分析技術(shù)與高度模擬人體生理微環(huán)境的優(yōu)勢(shì)，為腸道屏障功能檢測(cè)開(kāi)辟出一條高效,、精準(zhǔn)的全新方案,。
技術(shù)聯(lián)用的優(yōu)勢(shì)：
模擬生理環(huán)境：器官芯片可在芯片上構(gòu)建出包含腸道上皮細(xì)胞層、血管內(nèi)皮細(xì)胞層等類(lèi)似體內(nèi)腸道組織的結(jié)構(gòu),，并通過(guò)微通道內(nèi)液體流動(dòng)模擬腸道內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸,，而微孔板成像能對(duì)芯片內(nèi)細(xì)胞在這種模擬生理環(huán)境下的生長(zhǎng)、形態(tài)變化及功能表達(dá)進(jìn)行可視化監(jiān)測(cè),。
多維度數(shù)據(jù)獲?。何⒖装宄上窦夹g(shù)中的熒光顯微鏡可觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化反映分子表達(dá)水平或代謝活性，共聚焦顯微鏡能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞三維重建,，結(jié)合器官芯片模擬的復(fù)雜微環(huán)境,，可從細(xì)胞形態(tài)、分子表達(dá),、空間分布等多維度獲取細(xì)胞在 3D 培養(yǎng)條件下的數(shù)據(jù),。
設(shè)備與方法
設(shè)備
Agilent細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀
l 顯微成像和微孔板檢測(cè)的整合可同時(shí)提供細(xì)胞表型數(shù)據(jù)和定量數(shù)據(jù),，提高實(shí)驗(yàn)效率
l 集成化軟件簡(jiǎn)單易用，分析模塊不設(shè)限
l 圖像采集,、處理和數(shù)據(jù)分析輕松實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化流程
l 1.25 倍-100 倍物鏡，結(jié)合 7 種成像模式,，為用戶(hù)提供更多選擇
l 超過(guò) 20 種熒光通道選擇,，拼插式快捷更換，滿足現(xiàn)在和未來(lái)應(yīng)用
l 配置共聚焦成像和水鏡可清晰觀察3D細(xì)胞/類(lèi)器官等較厚樣本
l 環(huán)境控制包括溫度和 CO2/O2 控制與監(jiān)測(cè),，無(wú)需放置培養(yǎng)箱
l 支持與自動(dòng)化設(shè)備對(duì)接,，實(shí)現(xiàn)更高通量的檢測(cè)與成像分析
l 多種成像和檢測(cè)模式可進(jìn)行數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，適用于任何檢測(cè)
艾瑋得高通量無(wú)膜屏障芯片
屏障芯片產(chǎn)品是一種創(chuàng)新性的可灌注 3D 培養(yǎng)芯片,。它具備三通道獨(dú)立以及液體控制技術(shù)等特點(diǎn),，憑借這些特性，實(shí)驗(yàn)人員能夠靈活安排細(xì)胞 / 組織的空間分布與共培養(yǎng),，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和信號(hào)的無(wú)障礙交互,。在模型構(gòu)建方面，這款芯片優(yōu)勢(shì)明顯,，可構(gòu)建多種管狀及復(fù)雜模型。并且,，借助芯片自身的諸多優(yōu)勢(shì),，構(gòu)建出的模型能更接近人體實(shí)際情況。借助固體邊緣效應(yīng)構(gòu)建的無(wú)膜式屏障,，該芯片不僅能對(duì)三通道中的細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)定位，還能更好地促進(jìn)細(xì)胞間相互作用,。此外,，配合搖擺灌注儀使用時(shí),，該芯片還可達(dá)成連續(xù)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)分的充分交換,，為細(xì)胞和組織的培養(yǎng)提供更適宜的環(huán)境，助力科研人員開(kāi)展更深入的研究,。
聯(lián)用方法
（二）芯片構(gòu)建與細(xì)胞接種
l 首先,，在微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)腔室中，利用微加工技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)層,。例如,，將稀釋后的樣本細(xì)胞均勻地鋪展在腔室內(nèi),，使其形成類(lèi)似于體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。
l 將培養(yǎng)好的腸道上皮細(xì)胞以合適的密度接種到芯片的上皮細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域,，同時(shí)可根據(jù)需要接種其他輔助細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞等）,，構(gòu)建完整的腸道屏障模型。接種后,，將芯片放置在培養(yǎng)箱中,，讓細(xì)胞貼壁并開(kāi)始生長(zhǎng),。
l 在微孔板的孔中,，接種與芯片上相同類(lèi)型和狀態(tài)的細(xì)胞，作為對(duì)照或用于初步篩選實(shí)驗(yàn)條件,。
（三）成像與監(jiān)測(cè)
l 利用微孔板成像技術(shù),，在細(xì)胞接種后的不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)微孔板中的細(xì)胞進(jìn)行成像,。通過(guò)觀察細(xì)胞的形態(tài)、熒光標(biāo)記物的表達(dá)等情況,，初步評(píng)估細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和功能變化,。例如，使用熒光標(biāo)記的緊密連接蛋白抗體,，觀察細(xì)胞間緊密連接的形成情況,，以評(píng)估腸道屏障的完整性。
l 由于芯片內(nèi)細(xì)胞的 3D 結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,，成像時(shí)可采用共聚焦成像等技術(shù)（C10）,，獲取細(xì)胞在不同深度層面的信息，觀察細(xì)胞在模擬腸道微環(huán)境下的動(dòng)態(tài)變化,，如細(xì)胞的遷移,、分化以及屏障功能的改變等。
應(yīng)用案例
01細(xì)胞培養(yǎng)：
使用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系 Caco-2 在器官芯片中制備腸道模型,。器官芯片 的每個(gè)芯片由 9 個(gè)孔（3 x 3）組成,，通過(guò)三個(gè)微流體通道（寬 400 µm，高 220 µm）連接,。
02屏障完整性檢測(cè)：
在培養(yǎng)的第 6 天,，向培養(yǎng)基通道 1 中加入含有熒光染料(FITC-Dextran 150 kDa，TRITC-Dextran 4.4 kDa)和凋亡誘導(dǎo)劑 Staurosporine(0 至 50 µM)的培養(yǎng)基,，并立即使用 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)器官芯片進(jìn)行成像,。
Cytation 1 系統(tǒng)具有完善的環(huán)境控制，包括CO2/O2濃度控制和溫度控制,，將系統(tǒng)溫度設(shè)置并維持在 37 ℃,，在24小時(shí)內(nèi)每小時(shí)捕獲一次每個(gè) OrganoPlate® 芯片的熒光圖像,。
圖 2. 使用安捷倫 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行腸道屏障完整性測(cè)定
03結(jié)果與討論
Caco-2 細(xì)胞在器官芯片中培養(yǎng)，并用 Staurosporine(0 至 50 µM,，24 小時(shí))處理,，然后使用 Cytation 1 評(píng)估其屏障完整性。
圖 3-4 數(shù)據(jù)觀察到：未加細(xì)胞和 0 µM Staurosporine 條件作為對(duì)照,，顯示出預(yù)期的圖像和接近 1 和 0 的泄漏分?jǐn)?shù),。
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圖 3. Staurosporine 處理的 Caco-2 tubule 中 FITC - 葡聚糖（150 kDa）的滲透性
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圖 4. Staurosporine 處理的 Caco-2 tubule 中 TRITC-dextran（4.4 kDa）的滲透性
圖 5 顯示在 Staurosporine 處理的細(xì)胞中，觀察到劑量和時(shí)間依賴(lài)性的屏障完整性喪失,，表現(xiàn)為兩種熒光染料從培養(yǎng)基向凝膠通道的滲透,。通過(guò)計(jì)算泄露分?jǐn)?shù)和表觀滲透率（Papp），進(jìn)一步量化了屏障功能的破壞程度,。
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圖 5. 屏障完整性數(shù)據(jù)分析和表觀滲透率
如果想要在器官芯片上進(jìn)行更高分辨率的 3D 組織結(jié)構(gòu)重構(gòu),，推薦使用增加了轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦系統(tǒng)的 Cytation 高級(jí)型號(hào)：Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測(cè)系統(tǒng)。
圖 6. 器官芯片的 3D 渲染,。使用安捷倫 BioTek Cytation C10 共聚焦成像系統(tǒng)在 40 倍物鏡下獲取共聚焦熒光圖像,。以 1 µm的步進(jìn)在多個(gè) z 高度采集 3 x 3 圖像拼接，跨越 150 微米的 Z 高度范圍,。細(xì)胞核用 Hoechst 33342 標(biāo)記,，細(xì)胞膜用 GFP 標(biāo)記。3D 渲染使用安捷倫 BioTek Gen5 軟件中的 3D 查看器工具生成,。
引用文獻(xiàn)：
[1] Konig, J.et al. Human Intestinal Barrier Function in Healthand Disease. Clin Transl Gastroenterol. 2016.7 e196. DOl10.1038/ctg.2016.54
[2] Bowes,y.et al.Reducing Safety-Related Drug Attrition?The Use of In Vitro Pharmacological Profiling. Nat RevDrug Discov 2012,11,909-922.D01:10.1038/nrd3845
[3] Trietsch,S.y.et al. embrane-Free Culture and Real-Time Barrier Integrity Assessment of Perfused IntestinalEpithelium Tubes.Nat Commun.2017.8.262.DOl:10.1038/s41467-017-00259-3
[4] Johnson,D.How to Do Everything: Digital Camera Onlinel.cGraw Hill Professional. 2008.
[5] Ray, S.F. Applied Photographic Optics, 3rd Edition, Focal5.Press.2002.