聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在生物分子領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù),。Taq DNA聚合酶作為PCR反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，其性能直接影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,。本文主要介紹了Taq DNA聚合酶的來源,、特性、活性定義及質(zhì)量控制方法,，并探討了Taq DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中的使用方法及優(yōu)化策略,。

一、Taq DNA聚合酶的來源與特性

Taq DNA聚合酶是一種來源于嗜熱菌Thermus aquaticus的耐熱性DNA聚合酶,，通過大腸桿菌重組表達(dá)純化獲得,。該酶分子量為94kDa，與天然Taq DNA聚合酶具有相同的功能,。Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性,，但無3'→5'外切酶活性。這使得PCR產(chǎn)物的3'端帶有突出的A堿基,，便于克隆至T載體,。

二、Taq DNA聚合酶的活性定義及質(zhì)量控制

1. 活性定義：1個(gè)活性單位（U）定義為在74℃下,，30分鐘內(nèi)催化10 nmol dNTP摻入酸不溶物所需的酶量。

2. 質(zhì)量控制：Taq DNA聚合酶的蛋白純度通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測,，純度不低于95%,。此外,，還需進(jìn)行以下檢測：

（1）核酸內(nèi)切酶活性檢測：將5 U Taq DNA Polymerase與200 ng超螺旋質(zhì)粒DNA在37℃下共同溫育4小時(shí)，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測,，少于10%的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)變成缺刻或線性狀態(tài),。

（2）非特異性核酸酶活性檢測：將5 U Taq DNA Polymerase與15 ng雙鏈DNA片段在37℃溫育16小時(shí)，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈DNA底物無變化,。

（3）宿主DNA殘留檢測：使用大腸桿菌16S rDNA特異性引物探針組,，采用熒光定量PCR法檢測5 U Taq DNA Polymerase，大腸桿菌宿主基因組DNA殘留低于1 copy,。

三,、Taq DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中的使用方法及優(yōu)化策略

1. 使用方法：

（1）建議的PCR反應(yīng)體系：以50 μl體系為例，Taq DNA Polymerase（5 U/μl）0.25 μl,，10×Taq Reaction Buffer 5 μl,，dNTP（10 mM）1 μl，正向引物（10 μM）1 μl,，反向引物（10 μM）1 μl,，模板DNA x μl,，ddH2O補(bǔ)至50 μl,。

（2）常規(guī)PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 3~5分鐘，變性94℃ 30秒,，退火55~65℃ 30秒,，延伸72℃ 30~60秒/kb,，終延伸72℃ 5分鐘。

2. 優(yōu)化策略：

（1）引物設(shè)計(jì)：引物長度建議設(shè)定為18~25 bp,，GC含量為40%~60%,。引物終濃度推薦為0.2 μM,，效果不佳時(shí)可以在0.1~1 μM進(jìn)行調(diào)整,。

（2）模板濃度：不同模板最佳反應(yīng)濃度有所不同。以基因組DNA為模板時(shí),，一般使用量應(yīng)在10~400 ng；當(dāng)模板為質(zhì)?；虿《?/span>DNA時(shí),，一般使用量應(yīng)在10 pg~20 ng,。

（3）預(yù)變性條件：對(duì)于一些復(fù)雜模板,，如菌液,、菌落（尤其是酵母）的PCR擴(kuò)增,，預(yù)變性時(shí)間可適當(dāng)延長至10分鐘，以提高預(yù)變性效果,。

（4）目的片段長度：使用酵母菌液作為PCR擴(kuò)增模板時(shí)，建議目的片段長度不超過2.5 kb,；若超出2.5 kb，建議將酵母菌液預(yù)先進(jìn)處理,。

百時(shí)美的 Taq DNA Polymerase為來源于嗜熱菌Thermus aquaticus,，經(jīng)大腸桿菌重組表達(dá)純化獲得的耐熱性DNA聚合酶,，分子量為 94 kDa,，與天然Taq DNA 聚合酶具有相同的功能,。該酶具有 5'→ 3' 聚 合酶活性和 5'→3' 外切酶活性，但無3'→ 5'外切酶活性,。PCR 產(chǎn)物的3' 端帶有突出的 A 堿基，可克隆至 T 載體,。

總之,，Taq DNA聚合酶在PCR技術(shù)中具有重要作用。通過了解其特性,、活性定義及質(zhì)量控制方法,，合理優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及程序，可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求,，對(duì)Taq DNA聚合酶進(jìn)行優(yōu)化,，有助于提高PCR技術(shù)的應(yīng)用效果,。

蘇州阿爾法生物作為百時(shí)美生物的聯(lián)盟供應(yīng)商提供實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備,，實(shí)驗(yàn)耗材,，生物試劑的一站式服務(wù)，所提供的分子生物學(xué)試劑主要包括：限制性內(nèi)切酶AgeI、BamHI、BsaI,、EcoRI和HindIII等80多種,，taq聚合酶，逆轉(zhuǎn)試劑盒,，熒光定量試劑、體外轉(zhuǎn)錄酶等,。