在生物制藥領(lǐng)域,，單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建是藥物研發(fā)的關(guān)鍵步驟之一。SystImmune公司,，一家專注于抗體研發(fā)的公司,，面臨著快速構(gòu)建高產(chǎn)量表達(dá)雙特異性抗體的單克隆細(xì)胞系的挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn),， SystImmune采用了Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀,，提高了細(xì)胞系開(kāi)發(fā)的效率。 這里詳細(xì)介紹SystImmune公司如何利用 Cell Metric ™系統(tǒng)加速雙特異性抗體單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建,。

SystImmune的細(xì)胞系開(kāi)發(fā)流程

SystImmune使用CHOZN® (Sigma) 作為表達(dá)平臺(tái),。CHOZN® GS-/- CHO細(xì)胞系是一種內(nèi)源性谷氨酰胺合成酶敲除細(xì)胞株，為必需氨基酸谷氨酰胺營(yíng)養(yǎng)缺陷型,，很容易據(jù)此來(lái)進(jìn)行篩選。

1.微池轉(zhuǎn)染和挑選

CHOZN細(xì)胞被轉(zhuǎn)染進(jìn)感興趣的基因,，每孔鋪5000-10000細(xì)胞,。由于采用了CHOZN系統(tǒng),，回收率很高，例如接種2-5板,，回收率可達(dá)約80%,。到第14天時(shí)孔中會(huì)有大量多克隆細(xì)胞。由于擴(kuò)增所有微池是很困難的,，因此會(huì)進(jìn)行滴度測(cè)定來(lái)排除不表達(dá)的細(xì)胞微池,。

2.微池的擴(kuò)增和篩選

產(chǎn)物表達(dá)最高的50個(gè)微池會(huì)選來(lái)擴(kuò)增（通過(guò)靜態(tài)培養(yǎng)和搖瓶），篩選并做滴度測(cè)定,。靜態(tài)擴(kuò)增包括將微池細(xì)胞從96孔轉(zhuǎn)至24孔板,，然后轉(zhuǎn)至T25和T75瓶中培養(yǎng)。搖瓶擴(kuò)增包括將微池中的細(xì)胞擴(kuò)增,，后轉(zhuǎn)至30mL補(bǔ)料分批培養(yǎng)搖瓶中,。SystImmune要對(duì)30mL補(bǔ)料分批培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行滴度測(cè)定，這樣做的原因是有時(shí)靜態(tài)擴(kuò)增的滴度數(shù)據(jù)同最終生物反應(yīng)器中滴度數(shù)據(jù)并不一致,。

3.微池細(xì)胞有限稀釋

使用Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀進(jìn)行稀釋鋪板時(shí),，至少挑選3個(gè)微池，用40塊96孔板進(jìn)行有限稀釋操作,。先用0.3-1個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板,，而后選擇了合適的的0.5個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板。

4.克隆源性確證和存檔

Solentim Cell Metric imager用于對(duì)40塊細(xì)胞板進(jìn)行拍照,，分別追蹤其在Day 0, Day 1 和Day 2的細(xì)胞分裂情況,，并在Day 7拍照顯示其克隆形成情況。在此階段,，SystImmune確認(rèn)了約200-300個(gè)克隆有著高滴度值,，但通常選擇至少50個(gè)Cell Metric確認(rèn)的滴度最高的單細(xì)胞擴(kuò)增克隆。這種單細(xì)胞克隆的確認(rèn)是非常嚴(yán)格的,，并需要生成相關(guān)報(bào)告用于提交IND,。

5.克隆擴(kuò)增

先前步驟中選出的高表達(dá)克隆（基于圖像和滴度數(shù)據(jù)）用先前同樣的方法,，從靜態(tài)培養(yǎng)到搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增,。另用一個(gè)30mL搖瓶補(bǔ)料分批培養(yǎng)，將高表達(dá)克隆繼續(xù)擴(kuò)增,。

6.克隆評(píng)價(jià)

SystImmune基于細(xì)胞生長(zhǎng)和滴度測(cè)試來(lái)最終確定哪些克隆被送到生產(chǎn)部門,，并還需要將細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行純化交到分析部門，進(jìn)行蛋白質(zhì)量檢測(cè)——CE-SDS（毛細(xì)管電泳-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳）,，HPLC-SEC（高效液相-尺寸排阻色譜）,，CIEF（等電毛細(xì)聚焦），結(jié)合和功能測(cè)試,。他們同樣要檢測(cè)拷貝數(shù),，檢測(cè)支原體,。

7.批量擴(kuò)增生產(chǎn)

后來(lái)SystImmune挑選了8個(gè)產(chǎn)量較高的克隆送去生產(chǎn)部門，進(jìn)行3L生物反應(yīng)器發(fā)酵,，進(jìn)行活細(xì)胞密度（VCD）和IgG產(chǎn)量分析,。

8.產(chǎn)生候選克隆

將好的候選克隆被挑選出來(lái)，創(chuàng)建研究細(xì)胞庫(kù)（RCB）,。

細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程中面臨的挑戰(zhàn)

同其他公司的CLD部門一樣,，SystImmune公司在細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程中也面臨著一些關(guān)鍵的問(wèn)題：

l 細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程中多步驟的復(fù)雜性

l 部門人手不夠

l 降低時(shí)間周期及成本

l 每個(gè)步驟中形成良好的規(guī)則

l 提交IND申請(qǐng)時(shí)可以形成規(guī)范的文件

l 可以證實(shí)細(xì)胞的克隆源性

對(duì)于后面兩點(diǎn)，同其他公司一樣,，SystImmune公司已經(jīng)敏銳地覺(jué)察到FDA對(duì)于細(xì)胞系單克隆源性的要求,，FDA的Sarah Kennett博士曾做過(guò)“Establishing Clonal Cell Lines – A Regulatory Perspective’ presentation"的報(bào)告。里面概述了ICH Q5D的條款"For recombinant products, the cell substrate is the transfected cell containing the desired sequences which has been cloned from a single cell progenitor",。

為細(xì)胞的克隆源性存檔

SystImmune選擇在細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)過(guò)程中使用Solentim的Cell Metric CLD來(lái)為細(xì)胞的克隆源性存檔,。Cell Metric 單克隆細(xì)胞追蹤成像儀  可以對(duì)細(xì)胞孔進(jìn)行高銳利度的整孔成像，提供Day 0時(shí)的細(xì)胞狀態(tài),，從而為單克隆源性提供關(guān)鍵證據(jù),，因此只需要一輪克隆即可。

為了提供克隆源性的證據(jù),，SystImmune利用Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀的配套軟件的“輸出克隆報(bào)告"功能制作的報(bào)告文件,。報(bào)告中展示了對(duì)所需要的細(xì)胞孔的整孔成像，接種細(xì)胞的具體位置,，細(xì)胞如何隨時(shí)間逐漸分裂生長(zhǎng)為一個(gè)克隆團(tuán)（此處僅顯示了Day0和Day1）,。同樣地，孔內(nèi)同細(xì)胞形態(tài)相似的一些碎片和雜質(zhì)也會(huì)被拍到,。這些碎片或雜質(zhì)是不會(huì)隨著時(shí)間而發(fā)生任何形態(tài)上的變化的,，這也是證明該克隆團(tuán)為單克隆的重要基礎(chǔ)。

使用CHOZN平臺(tái)和以前的兩輪有限稀釋,，SystImmune大概要用20周的時(shí)間獲得一個(gè)好的候選細(xì)胞系交給生產(chǎn)部門,，這是一個(gè)非常耗時(shí)的過(guò)程，對(duì)于提交一個(gè)IND申請(qǐng)這是一個(gè)重要的限速步驟,。

闡明細(xì)胞的單克隆源性在政策法規(guī)層面是非常重要的,。SystImmune使用Cell Metric CLD能夠很好的捕獲細(xì)胞接種，數(shù)量增長(zhǎng)直至形成克隆團(tuán)的圖像,。

使用Cell Metric,，SystImmune在細(xì)胞系建立過(guò)程中可以去掉一輪的有限稀釋，這意味著可以節(jié)省6-8周的時(shí)間仍能夠達(dá)到法規(guī)的要求,。通過(guò)這種方式,，SystImmune不僅加快了細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)速度，還確保了細(xì)胞系單克隆源性的合規(guī)性，這對(duì)于IND申請(qǐng)的提交至關(guān)重要,。

SystImmune的這個(gè)案例充分展示了Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀在生物制藥研發(fā)中的巨大價(jià)值,。通過(guò)提高細(xì)胞系開(kāi)發(fā)的效率和確保單克隆源性，Cell Metric為生物制藥公司提供了加速藥物上市的關(guān)鍵工具,。這不僅縮短了研發(fā)周期，還能在確保產(chǎn)品質(zhì)量和合規(guī)性的同時(shí),，降低研發(fā)成本,。

蘇州阿爾法生物的STUDIUS生態(tài)系統(tǒng)，通過(guò)整合VIPS PRO單細(xì)胞鋪板,、Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀以及ICON細(xì)胞成像系統(tǒng),，進(jìn)行 IgG產(chǎn)率評(píng)估，為細(xì)胞株構(gòu)建提供了一個(gè)高效的一體化解決方案,。這個(gè)軟件平臺(tái)允許科學(xué)家根據(jù)特定參數(shù)自定義分析,，并自動(dòng)、即時(shí)地處理數(shù)據(jù),，縮短了克隆排名和選擇所需的時(shí)間,。這些 實(shí)驗(yàn)室儀器的使用不僅提高了細(xì)胞株構(gòu)建的效率和精確性，還幫助科學(xué)家加速了整個(gè)細(xì)胞開(kāi)發(fā)過(guò)程,。