一,、實驗目的
掌握PCR反應的基本原理與實驗技術,。
二、實驗原理
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反應,，可以選擇性擴增一段DNA序列,。其基本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈,，DNA樣品中,，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時,，就可以合成模板DNA的互補鏈,，反應完成后，將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性,，溫度下降后,，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應,。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增,。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性,，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合.
3. 延伸：溶液反應溫度升至72℃,，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）,，按5ˊ→3ˊ方向復制出互補DNA,。
上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性,、低溫退火,、中溫延伸3個階段。從理論上講,，每經(jīng)過一個循環(huán),，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,，經(jīng)過25～30個循環(huán)后DNA可擴增106～109倍,。
典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖液,、dNTPs,、MgCl2、兩個合成的DNA引物,、耐熱Taq聚合酶,。
三、 試劑和緩沖液
PCR mix,，10×PCR Buffer,，引物，模板,。
四,、 儀器耗材
PCR儀，掌上離心機,，微量移液器,，槍頭，1.5mL離心管,，PCR管,，冰盒。
五,、 實驗步驟（每人一組,，每人做1管,，純化時兩人一組）
1. 查找基因序列，設計合成PCR引物,。注意合成引物約需一周時間,，請?zhí)崆皽蕚洹Ｔ敿毑襟E請參考實驗一后面的附件內(nèi)容,。
2. 在50μL反應體系中,，加入：
模板DNA (5ng/μL) 1
引物P1P2 (10μmol/L) 各1
2×PCR mix 25
ddH2O 22
在冰上配制，注意混勻后離心,。加入10μL石蠟油覆蓋,。
3. 在PCR儀中預變性94℃ 4min，然后循環(huán)：94℃ 30s,，55℃ 30s,，72℃ 60s，30個循環(huán),；循環(huán)結(jié)束后,，72℃10min 。擴增的PCR產(chǎn)物4℃保存,。（OC-II）
4. 取PCR產(chǎn)物2-5μL與上樣緩沖液混合,，點樣,。
5. 1% 瓊脂糖膠電泳,，160V 30-40min。
6. 電泳結(jié)束,，溴化乙錠染色5-10分鐘,。
7. 用凝膠成像儀觀察、拍照,。
8. PCR產(chǎn)物切膠回收,。步驟參見膠回收Kit說明書。
A 酶切片段的純化及其回收
使用切膠回收kit進行PCR產(chǎn)物的回收,。具體操作步驟如下,，詳見說明書。
1）稱回收的膠,，每0.1g加100µL XP2 ,；
2）55度5-7分鐘至溶膠 ；
3）取溶膠液加入回收柱子,，最大體積700µL,；10000g, 1min；
4) 加300µl XP2 ,，10000g 1min,；
5）加700µl SPW ,，10000g 1min；
6）重復5）,；
7）空管離心2min,，13000 g
8）干燥，加15-30µL Eulation Buffer
9）13000 g,，1min
DNA產(chǎn)物純化kit,，操作步驟：
將PCR反應液（40ul）或酶促反應液移至一干凈的1.5ml離心管中，加入5倍體積的buffer3,，充分混勻,。（用前確定加入適量的異丙醇）
將混合液全部移入吸附柱，8000g離心30s,；將濾出液再次加入到吸附柱中再次過柱,，8000g離心30s（此步驟可以提高回收效率）；倒掉收集管中的液體,，將吸附柱放入同一收集管中,。
向吸附柱中加入500ul Wash Solution（加到壁上），9000g離心30s,。倒掉收集管中的液體,，將吸附柱放入同一收集管中。（Wash Solution使用前請檢查是否已加入正確量的無水乙醇）
重復步驟3一次
將空吸附柱和收集管放入離心機,，9000g離心1min,。下管扔掉，上管放入1.5ml離心管中,，晾干,。（殘余的乙醇會嚴重影響得率和后續(xù)試驗）
在吸附膜中央加入25ul 60℃提前預熱（進一步提高得率）的Elution Buffer（加到濾芯上），室溫靜置1min,，9000g離心1min,。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗。注意：本步驟中,，所有轉(zhuǎn)速單位為g,。
B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法對PCR產(chǎn)物回收。具體操作步驟如下,。
加入等體積的冰無水乙醇,，加入1/10體積的KAc（3M pH5.2）。
上下顛倒混勻,，-20℃30min,；12000r/min 4℃ 10min。
棄上清,，加入70%的冰乙醇,，輕輕混勻,。12000r/min 4℃離心10min。
棄上清,，室溫干燥,，至無乙醇。
加入適量體積的ddH2O,。六,、注意事項
1. 進行PCR反應時，注意加入試劑的順序,。注意加入任何一種試劑后均需混勻,。
2. 本實驗使用2xPCR mix，包含有dNTPs和Taq酶,。
3. 引物的稀釋：分子量24bp*324.5 = 7788,，質(zhì)量數(shù)10OD*33 ＝33ug，摩爾數(shù)=33/7788 =4.2 nmol,，母液濃度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L,，使用時取母液稀釋5倍，則終濃度為10μmol/L,。
4. PCR擴增產(chǎn)物共20μL,，其中2-5 μL用于檢測，剩余的用于純化回收,。具體步驟參考 實驗二C內(nèi)容,。
5. 使用自己的實驗材料進行PCR擴增的學生，請?zhí)崆皽蕚湟锖湍０?，并與任課教師協(xié)商,。
思考題：
影響PCR反應特異性的因素有哪些,？請分析原因及解決辦法,。
PCR引物設計的原則有哪些？請設計本實驗的PCR引物,，并寫到實驗論文中,。
附1：基因序列查找和PCR引物設計
實驗課進行之前，需要利用NCBI查找基因序列,，并設計PCR引物,。
進入NCBI 后，在Search的下拉框中選擇Nucleotide,，再輸入基因名稱,，點擊Search即可。也可輸入具體的物種名以縮小范圍,，獲得cDNA 序列信息,。例如：水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因（Oryzacystatin, OC）序列信息
OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCGTTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGATGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGGCCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGGGCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCCTCGACGACGCCACCGCCTAA
引物設計,。要求擴增上述完整的cDNA 序列，并在兩端添加酶切位點,，5‘添加EcoRI（GAATTC）,， 3‘端添加HindIII （AAGCTT）。以便克隆到pET30a的相應位點,。注意PCR產(chǎn)物中沒有上述酶切位點,，否則不能使用。
prim-OC2-R GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC 26bp 下劃線為EcoRI識別序列
#prim-OC2-F GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC 26bp 下劃線為HindIII 識別序列
T載體通用引物
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
