PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）在遺傳學(xué),、生物醫(yī)學(xué)和生物工程等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用,。PCR反應(yīng)體系是指所有反應(yīng)組分的配比和濃度，而PCR反應(yīng)條件則包括溫度,、時間和核酸擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等因素,。正確選擇和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，對于保證PCR反應(yīng)的高效和可靠具有至關(guān)重要的意義,。在下文中,，我們將詳細(xì)探討PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的重要性，并介紹一些常用的優(yōu)化策略,。

一,、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

　　　　　　 10×擴(kuò)增緩沖液 　 10ul

　　　　　　 4種dNTP混合物 　 各200umol/L

　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　

　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　

　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　

　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L

　　　　　　 加雙或三蒸水至 　100ul

　　二、PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶,、dNTP、模板和Mg2+

　　引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度,。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp,，常用為20bp左右,。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段,。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC盡量隨機分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補,，特別是3'端的互補,，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。

⑤引物3'端的堿基,，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點,， 這對酶切分析或分子克隆很有好處,。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以min引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機會,。

　　酶及其濃度　目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng),， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶,。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時),，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。

　　dNTP的質(zhì)量與濃度　dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性,。dNTP溶液呈酸性,，使用時應(yīng)配成高濃度后,，以1M NaOH或1M Tris,。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝,， -20℃冰凍保存,。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,，dNTP應(yīng)為50～200umol/L,，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),，就會引起錯配,。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低,。

　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量與純化程度,，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本,。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白,，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀,； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng),。一般臨床檢測標(biāo)本,，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體,，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,，要防止RNase降解RNA,。

　　Mg2+濃度　Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中,，各種dNTP濃度為200umol/L時,，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,，反應(yīng)特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,，使反應(yīng)產(chǎn)物減少,。

三、PCR反應(yīng)條件的選擇

　　PCR反應(yīng)條件為溫度,、時間和循環(huán)次數(shù),。

　　溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,，雙鏈DNA在90～95℃變性,，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃,，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法,， 除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性,，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性),。

　　①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不夠是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因,。一般情況下,，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間,，但溫度不能過高,，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物變性,，就會導(dǎo)致PCR失敗,。

　　②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合,。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞,。退火溫度與時間,，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,，還有靶基序列的長度,。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物,，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想,。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

　　　　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

　　　　　復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

　　在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,， 提高PCR反應(yīng)的特異性,。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間全結(jié)合,。

　　③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：

　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　高于90℃時,， DNA合成幾乎不能進(jìn)行,。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合,。PCR延伸反應(yīng)的時間,，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的,。3～4kb的靶序列需3～4min,；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn),。對低濃度模板的擴(kuò)增,，延伸時間要稍長些。

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