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凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為哪幾個過程
蛋白質(zhì)被認(rèn)為是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分,。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的*來源,，具有糖類和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機化合物的重要標(biāo)志,。在檢驗食品中蛋白質(zhì)時,，通常是先檢定出食品中的總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù),，以此得到蛋白質(zhì)含量,。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法,。凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為樣品消化,、蒸餾、吸收和滴定過程,。
一.原理
向樣品中加入濃硫酸和催化劑,，充分混勻，然后加熱消化分解,，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水,，其中的有機氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離,，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定,，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量,。
二.樣品消化
濃硫酸具有脫水性和氧化性,，可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水,，蛋白質(zhì)會分解為氨,，然后氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質(zhì)分解,。硫酸鉀可以提高溶液的沸點,，一般情況下,，純硫酸的沸點在340 ℃左右，但是在添加硫酸鉀后,，可提高至400 ℃以上,。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀,，否則會因為溫度過高,，使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外,，還可以指示消化終點的到達,，有機物全部消化*后，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色,，硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑,。
三.蒸餾
消化液中的硫酸銨在堿性環(huán)境下會轉(zhuǎn)化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出,，影響測定結(jié)果,，所以水蒸氣發(fā)生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱堿鹽,，需要足夠的堿液使結(jié)合態(tài)的氨*反應(yīng)并釋放出來,，這個過程中的氫氧化鈉一定要過量，過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉淀,，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀,。檢驗蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法,，NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應(yīng)生成棕紅色的dian化汞銨化合物。
四.吸收
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收,，硼酸有吸收氨的作用,，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時指示劑的變色反應(yīng),。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱,，從而造成損失，故一般不超過40 ℃,。
五.滴定
待吸收*后,，用硫酸或者鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結(jié)果的性,，必須按照要求進行配制和標(biāo)定,。混合指示劑在中性溶液中呈灰色,，滴定終點時液體呈灰色,。