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細(xì)菌培養(yǎng)方法
閱讀：4913 發(fā)布時(shí)間：2020-8-6細(xì)菌培養(yǎng)方法
1儀器：
K罩細(xì)菌過濾效率檢測儀,、高壓蒸汽滅菌器,、電子天平,、生化培養(yǎng)箱、軌道式振蕩器,、超潔凈工作臺(tái),、菌落計(jì)數(shù)器
- 試劑及材料：
蒸餾水、75%酒精,、金黃色葡萄球菌ATCC 6538,、胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）,、蛋白胨水,、酒精燈、90mm平皿,、500ml錐形瓶
- TSA培養(yǎng)基的配制：
取一個(gè)干凈的500ml的錐形瓶,，稱取16g TSA,溶于400ml水中，包扎后放入高壓蒸汽滅菌器中滅菌（121℃-123℃,，20min）,，滅菌結(jié)束后取出，待其冷卻至50℃-60℃時(shí),，將液體培養(yǎng)基逐個(gè)倒25ml左右入無菌培養(yǎng)皿中,，操作應(yīng)在超潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行，以酒精燈的火焰周圍作為無菌區(qū)域,，避免雜菌污染,。
待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將其倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中,，37℃條件下培養(yǎng)24h,，將有菌落生長的培養(yǎng)基舍棄不用,，無雜菌生長的取出備用，盡量現(xiàn)用現(xiàn)做,，如不能盡快使用,，應(yīng)密封放在4℃冰箱內(nèi)冷藏，可保存3-4天,。
- 菌懸液的制備：
將金黃色葡萄球菌ATCC6538接種在已滅菌好的100mlTSB(胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基）中,，在37℃震蕩培養(yǎng)24h。
用無菌移液槍取出上述培養(yǎng)好的菌液1ml注入9ml一滅菌好的蛋白胨水中,，混勻,，一次逐級(jí)稀釋10倍，稀釋至10-7(根據(jù)菌種實(shí)際情況來判斷需要稀釋至多少）,，然后分別取10-5,、10-6、10-7菌液各0.1ml接種到備TSA培養(yǎng)基上,，每個(gè)稀釋稀釋倍數(shù)做少4組平行,，用涂布棒沿同一方向涂抹均勻，（不要涂抹到培養(yǎng)皿的邊緣上）,，放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，培養(yǎng)溫度(37±2)℃,培養(yǎng)時(shí)間（24±2）h。培養(yǎng)結(jié)束后用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),，根據(jù)稀釋倍數(shù)確定原始菌液的濃度,。
計(jì)算公式：原始濃度=（A/V)*D
A為培養(yǎng)皿上的平均菌落數(shù)
V為接種液的體積
D為稀釋倍數(shù)
按照上述方法確定原始菌液的濃度后，用1.5%的蛋白胨水將上述培養(yǎng)物稀釋至約5*105cfu/ml,。
TSB的制備：稱取3gTSB, 溶于100ml水中,，放入高壓蒸汽滅菌器中（121℃-123℃，20min）滅菌,，冷卻后備用,。
蛋白胨水的配制：稱取1.5g蛋白胨溶于100ml水中，包扎,，放入高壓蒸汽滅菌器中（121℃-123℃,，20min）滅菌，冷卻后備用,。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后逐級(jí)取出培養(yǎng)皿并蓋上皿蓋,，標(biāo)記后倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24-48h.試驗(yàn)中,，陽性對(duì)照組應(yīng)進(jìn)行至少兩次實(shí)驗(yàn),，終陽性質(zhì)控結(jié)果取平均值。
培養(yǎng)結(jié)束后,，將所有培養(yǎng)皿取出,，使用菌落計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù),，并將每一級(jí)菌落數(shù)對(duì)應(yīng)陽性孔轉(zhuǎn)換表進(jìn)行轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后的數(shù)值求和,，即得出菌落總數(shù),，陽性質(zhì)控值范圍應(yīng)在（2200±500）cfu之間。
細(xì)菌過濾效率計(jì)算公式如下：
BFE=(C-T)/C*
式中：C為陽性質(zhì)控平均值,，T為實(shí)驗(yàn)組菌落總和