非洲綠猴腎細胞VERO

MEM+10%FBS+1%P/S

貼壁生長

細胞死亡及生長異常

1、首先講一下細胞生長緩慢的原因：

a)更換了血清或者培養(yǎng)基,，細胞需要一段時間適應一下,；

b)由于細胞的特殊種類，培養(yǎng)基中缺少某些生長因子,；

c)培養(yǎng)基中有少量真菌或者細菌污染,；

d)傳代的時候細胞密度過低；

e)細胞狀態(tài)老化,；

f)支原體污染。

2,、解決上述問題的方法：

a)如果實驗室沒有某種細胞最適宜的培養(yǎng)基,，可以先用原培養(yǎng)條件凍存一些，然后逐漸增加新的培養(yǎng)基比例,，25%,、50%、75%到100%,，傳代3-5次后,，讓細胞慢慢適應。

b)判斷是不是培養(yǎng)基發(fā)生污染,，可以先不加抗生素,，觀察細胞狀態(tài)。

c)增加細胞的接種密度,。

d)發(fā)現(xiàn)細胞老化的時候,，及時更換新的細胞。

e)如果懷疑是支原體污染,，一定要隔離疑似污染的培養(yǎng)皿,，及時清潔消毒孵箱。

3,、造成細胞死亡的原因：

a)細胞消化過度,；

b)沒有及時換液，營養(yǎng)成分消耗殆盡,；

c)如果前一天細胞的狀態(tài)很好,，換液之后就全死了，應該考慮是否是培養(yǎng)基或者血清的問題,。

4,、如何判定細胞是否發(fā)生支原體污染：可以選用直接培養(yǎng)法、熒光染色或PCR方法檢測，比較常用的是PCR,。當細胞發(fā)生支原體污染時,，原則上是能夠去除支原體的，但是整個過程耗時耗力,，還要考驗個人操作能力,。所以如果不是處于細胞存量很少的情況下，建議發(fā)現(xiàn)污染時立刻棄掉,，重新培養(yǎng),。

5、如果孵箱中只是某種細胞持續(xù)性大量死亡,，而其他細胞狀態(tài)都沒問題的話,，基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類細胞的真菌或細菌，遇到這種情況,，小六兒也不知道該怎么做,，只能是先停一段時間看看。,。,。。,。,。

5、其他注意事項：每個星期都要更換孵箱底盤中的水（紫外照射后超純水）,；每兩周消毒一次孵箱：75%酒精擦拭一遍后,，再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍（都用超純水配制）；可以在孵箱底部放一個燒杯,，里面放入飽和硫酸銅,，可以抑制霉菌生長。不過也有人說硫酸銅會改變孵箱的PH值,，如果不是孵箱污染的情況很嚴重,，建議不要使用。

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人膽囊上皮細胞永生化+GFP

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小鼠角膜上皮細胞永生化

非洲綠猴腎細胞VERO

細胞復蘇

細胞復蘇和凍存講究“慢凍快溶",，復蘇時一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細胞凍存液快速融化至37℃,，使胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶,，對細胞造成損害,。

復蘇準備

?打開水浴鍋加熱至37℃。

? 超凈臺上放好離心管（一般15ml的）,，細胞培養(yǎng)瓶,，移液管,，紫外滅菌至少20至30分鐘，吹風5至10分鐘除去臭氧,。

?37℃預熱好要復蘇細胞的培養(yǎng)液,，也可以不用預熱培養(yǎng)液，根據(jù)細胞情況選擇,。

?向離心管中加約5至10ml培養(yǎng)液,，從液氮罐或-80℃中取出凍存細胞，立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動,，待融化后（約2min即可）立即將解凍的細胞轉移至含培養(yǎng)液的離心管中,，800-1000rpm下離心5min，棄上清,，加適量*培養(yǎng)液輕輕吹打重懸細胞后轉移至細胞培養(yǎng)瓶中,，輕晃使瓶底液體分散均勻，標好細胞名稱,、代數(shù),、復蘇日期，顯微鏡下觀察后放入37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱中。一般貼壁細胞過夜即可貼壁,，換液和傳代時間根據(jù)不同細胞生長情況而定,。

細胞復蘇注意事項

?復蘇時動作要快，盡量減少胞內形成冰晶,，影響復蘇后細胞活率,。

? 融化時盡量不要碰到管口，以免容易造成污染,。

?若一次性需要復蘇細胞很多,，可以分批水浴解凍，防止傳熱不佳使得細胞融化時間延長,。

?若需要同時復蘇好幾種細胞,，提前在離心管和培養(yǎng)瓶上做好標記，或記住自己擺放的位置,，不要弄混亂,。