人脂肪間充質干細胞 （國家干細胞資源庫）

人脂肪間充質干細胞培養(yǎng)基

貼壁 呈梭形

細胞培養(yǎng)的原理和步驟,，簡單好用以及精確！

今天我們要講解的是,，細胞培養(yǎng)的原理和步驟,，簡單好用以及精確，學完之后,，相信你對細胞培養(yǎng)將不再陌生,。接下來就開始今天的學習吧！

細胞培養(yǎng):體外模擬體內(nèi)需要的生長條件（溫度,，營養(yǎng)等）,，然后加上一些處理條件，比如做藥物篩選,，就可以做抗性基因的表達的篩選,，比如還可以測定某個基因敲低或是過表達的產(chǎn)物，這個當然要結合WB來看最后基因的表達產(chǎn)物是否升高哦,，細胞培養(yǎng)的應用還有很多,。

細胞培養(yǎng)的基本原理：細胞傳代（生存空間和營養(yǎng)不足，長得太密,，代謝廢物太多,，要洗洗，同時也要分離出一部分細胞,，要加入新的培養(yǎng)液）,，換液（生存空間和營養(yǎng)剩余，但是代謝廢物太多,，要洗洗,，要吃飯，才能長好,，所以要洗和加入新鮮培養(yǎng)基）,，凍存（太多了,，先存起來，液氮里面里就是低溫,，保存能量,，活得久），復蘇（解凍,，恢復吃飯的能力,，恢復生長。）這四步,。

細胞培養(yǎng)的基本步驟（一定要明白每個步驟的意義和目的）：

01細胞傳代（貼壁細胞）：

試劑：PBS,胰酶,，含血清的培養(yǎng)基；

流程：顯微鏡下看一看培養(yǎng)皿里的細胞多不多,，太多（80%~90%）會導致代謝廢物很多,，先吸掉廢液，再用PBS洗一洗,，同時太多會導致細胞黏在一起,，這時候就需要加點胰酶消除它們之間的粘性，是否消除完,，在顯微鏡下看一看,，看完加入適宜的含血清的培養(yǎng)基，中和一下胰酶,，這叫吹打,，除此之外，細胞太多了,，把一部分細胞移出來,，加入適量的培養(yǎng)基放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng),，這叫傳代,。

02細胞換液：

試劑：PBS，含血清的培養(yǎng)基,；

流程：先吸掉代謝廢物（即細胞瓶中的培養(yǎng)液）,，再用PBS洗一洗，由于細胞長得不是很多,，細胞之間沒有黏在一起,，因此不需要加入胰酶來消除它們之間的粘性。由于細胞要吃飯,，加入新鮮的含血清的培養(yǎng)基,，最后放到孵箱里面進行培養(yǎng)。

03細胞凍存：

試劑：凍存液,，PBS,，胰酶,，含血清的培養(yǎng)基；

流程：要凍存,，先配置凍存液,，凍存液包含了：DMSO：防止在低溫（零度以下至-196℃）保存細胞時，細胞內(nèi)液會形成冰晶,，滲透壓會發(fā)生改變,，細胞結構會出現(xiàn)紊亂，會導致細胞出現(xiàn)損傷,。凍存液制備時,，一般需與血清一起配置：因為兩者互融時，會散發(fā)熱量,，所以凍存液需提前制備,。

因為細胞太多了，需要凍存,，所以要先看一看,，吸一吸，洗一洗,，分一分,，中和一下，吹打制成細胞懸液,，離心,，吸掉上清液，加入凍存液,，輕輕吹吸均勻,，每管等量1ml裝入凍存管，4℃20min,-20℃30min,-80℃過夜,，最后放入液氮罐,。

04細胞復蘇：

試劑：含血清的培養(yǎng)基；

流程：從液氮中取出凍存管,，迅速（小于3min）置于37℃水浴鍋中,，解凍時，邊晃動邊觀察,，當看到只有一小塊冰存在時,，即可從水浴鍋中取出，打開凍存管,，迅速將細胞懸液吸到離心管中,，輕輕混勻，1000r/min,離心五分鐘,，吸掉上清液,，沉淀中加入適量培養(yǎng)液,，放入孵箱中，培養(yǎng),。還有就是：復蘇的細胞,，需要在24小時后，換一次培養(yǎng)液,。

最后：在這里特別感謝B站上無私分享的細胞培養(yǎng)的視頻資源,，正是你們的分享，幫助了我,，我也會繼續(xù)把我學到的繼續(xù)分享,，幫助更多的人！如果大家想要獲得這份視頻資源的話,，可以在后臺私聊小編獲取哦,，里面關于細胞培養(yǎng)的知識講解的超級詳細！明天我會繼續(xù)介紹細胞培養(yǎng)的一些注意事項以及WB的操作的步驟和原理,。

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人脂肪間充質干細胞

隨著細胞培養(yǎng)技術的不斷發(fā)展和普及,，細胞培養(yǎng)已經(jīng)成為細胞學、遺傳學,、免疫學,、實驗醫(yī)學和腫瘤學等多種學科研究的重要工具。然而,，要進行一次成功的細胞培養(yǎng)并不是件輕松簡單的事情,。

要想在一次細胞培養(yǎng)過程中獲得足量且優(yōu)質的培養(yǎng)物，通常要做到以下幾點：活力好且無污染的種子細胞,；適合該細胞生長的*培養(yǎng)基,；安全無污染的試劑耗材；嚴格的無菌操作,；完備的細胞培養(yǎng)知識體系,。在這幾點當中，有些小的細節(jié)往往容易被忽視,，快來看看你是否中過招吧,！

1.及時保種—未雨綢繆,，有備無患：就算是細胞培養(yǎng)經(jīng)驗再豐富,，細胞房條件再好，也無法100%避免微生物污染,。一旦培養(yǎng)物發(fā)生污染,，將會很難補救。所以,，在拿到種子細胞后,，及時“備份"不失為一種明智之舉,。具體做法是：如果拿到的是一瓶密度合適的活細胞（以T25培養(yǎng)瓶為例）--第一次傳代時，一半細胞直接凍存一支保種,，剩下一半細胞接種至一個（或多個,，比例視細胞增殖速度、細胞類型而定）新的培養(yǎng)瓶,；如果拿到的是凍存管--先復蘇至一個培養(yǎng)瓶,，待細胞長到傳代密度后，按上面活細胞處理方法保種,。這樣一來,，可以大大減少培養(yǎng)物還未大量擴增就被污染或狀態(tài)差導致無種子可用的尷尬境地啦！

2.PBS的選用：傳代之前需要用PBS洗去殘留培養(yǎng)基是因為其中的Ca+,、Mg+會降低胰蛋白酶活性,。所以，一定要使用DPBS或者不含Ca+,、Mg+的PBS哦,！否則可能會出現(xiàn)消化時間變長、消化不*甚至消化不下來細胞的情況,。

3. 消化時間的把握：說明書上的消化時間僅供參考,，不要*遵循說明書上的消化時間，因為消化時間和細胞密度,、胰酶效價甚至細胞狀態(tài)有關,。要邊消化邊在顯微鏡下觀察（期間不要頻繁晃動培養(yǎng)瓶），把握最佳的消化時間是細胞培養(yǎng)中的重中之重,！

4,、消化終止液的選用：一般使用2倍胰酶體積的*培養(yǎng)基或者等體積大豆胰蛋白酶抑制劑來終止胰酶消化作用，但在使用*培養(yǎng)基終止時要注意必須確認該*培養(yǎng)基含有10%FBS,。如果該細胞采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),，要使用等體積大豆胰蛋白酶抑制劑來終止消化。

5.培養(yǎng)基的小細節(jié)：培養(yǎng)基能否用來培養(yǎng)你的細胞的關注點除了配方是否合適,、是否在保質期內(nèi),、有無微生物污染以外，還需關注培養(yǎng)基PH值--最直觀的方法是看培養(yǎng)基是否變成紫紅色,。如果培養(yǎng)基是紫紅色,，說明此時PH偏高，呈堿性,。很多細胞對PH值較為敏感（如BV-2,，THP-1），偏堿可能導致細胞狀態(tài)差甚至凋亡,。為了避免出現(xiàn)這種情況,，可在接種細胞前將適量培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)瓶,，然后放入CO2培養(yǎng)箱靜置20Min以調(diào)整PH（非透氣瓶要擰松瓶口）?？梢赃@么做的原因是因為絕大多數(shù)培養(yǎng)基（L-15培養(yǎng)基除外）都具PH緩沖系統(tǒng),。

6.經(jīng)常鋪不勻細胞怎么辦：一般使用“十字法"搖勻細胞，但如果把握不好力度和搖晃次數(shù)的話很可能無法鋪勻細胞,，為自己的實驗或下次傳代帶來不必要的麻煩,。解決辦法是：將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶后立起培養(yǎng)瓶輕輕吹打培養(yǎng)基2-3次后立即平放入培養(yǎng)箱，在細胞貼壁前不再搬動培養(yǎng)瓶,。