小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶，CT26+luc

細(xì)胞介紹：

CT26細(xì)胞是被N-亞硝基-N-甲基脲烷（NNMU）誘導(dǎo)得到的未分化的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞,，該細(xì)胞的一個(gè)克隆形成的細(xì)胞系被命名為CT26.WT,。CT26.WT被逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN穩(wěn)定轉(zhuǎn)化形成了一個(gè)致死性的亞克隆CT26.CL25，這一病毒載體含有lacZ基因,、編碼腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和beta半乳糖苷酶,。CT26.WT和CT26.CL25細(xì)胞在小鼠中生長(zhǎng)速度和致死率都很相似,，不同的是CT26.CL25細(xì)胞可以表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原和beta半乳糖苷酶，因此這兩株細(xì)胞可以聯(lián)合用于免疫和宿主免疫反應(yīng)的研究,。該細(xì)胞通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因,。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：小鼠結(jié)腸

2） 形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x10⁶  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用,。

細(xì)胞篩選：

該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Luc的細(xì)胞,，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其Luc熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱,。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度,，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選。 建議收到細(xì)胞后至少傳3代,，凍存留種后再進(jìn)行篩選,。

初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時(shí)，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的*培養(yǎng)基維持培養(yǎng),，若無(wú)細(xì)胞漂浮或者漂浮較少,，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的*培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推,，至最高藥物濃度為5ug/ml,。若篩選過(guò)程中，漂浮細(xì)胞大于60%,，則停止篩選,，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約80%,，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選,。當(dāng)加入5ug/ml嘌呤霉素時(shí)細(xì)胞正常增殖，可停止篩選,，用不含藥*培養(yǎng)基正常培養(yǎng),。

運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系,。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作,。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們,。

2）請(qǐng)?jiān)?/span>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過(guò)程中,，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收,。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 ,。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清,，10%,；雙抗，1%,。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,，95%；二氧化碳,，5%,。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3） 凍存液：90%血清,，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

二．細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液,，*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜,。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL）,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化,。 

3.輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行,。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例,；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中,，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度,。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min,，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ,，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中,，標(biāo)注好名稱、代數(shù),、日期等信息,。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜,，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存,。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶,，CT26+luc 

注意事項(xiàng)：

1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù),，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套,、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒(méi)在液氮中會(huì)泄漏,，并會(huì)慢慢充滿液氮,。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子,，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害,。

★ 我們需要知道都有哪些種類的牛血清和它們的用途：

1、透析血清

分子量小于10,000的分子如氨基酸,、葡萄糖,、鹽離子和未結(jié)合的蛋白均被移除。透析血清主要用在進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)化和標(biāo)定特定成分進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)中,。

2,、碳吸附血清

使用活性和右旋糖苷去除血清中的親脂類(lipophilic)物質(zhì)，如某些激素,、細(xì)胞因子,、生長(zhǎng)因子等，去除作用對(duì)分子量大小并無(wú)區(qū)分,。碳吸附胎牛血清常用于體外培養(yǎng)研究驗(yàn)證激素的作用效果,。

3,、去外泌體血清

適用于收集細(xì)胞分泌的外泌體時(shí)使用,。

4、低IgG血清

用于研究抗體,、病毒和病毒反應(yīng),、細(xì)胞表面抗原表位。

5,、四環(huán)素血清

應(yīng)用于使用敏感四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)(Tet-on, Tet-off),，以及其它對(duì)四環(huán)素敏感的實(shí)驗(yàn)中。

6,、IR (輻照)

鈷60伽馬輻照劑量在3.5Mrad. 通過(guò)直接與間接作用將生物大分子（如核酸）鍵結(jié)破壞,，人畜用藥物/疫苗，及對(duì)微生物負(fù)荷(Bioburden)要求水平的實(shí)驗(yàn),。

7,、HI (熱滅活)處理血清

56℃, 30Min, 破壞補(bǔ)體，確保細(xì)胞與抗體結(jié)合不會(huì)發(fā)生裂解,。

8,、胚胎干細(xì)胞（ES）專用血清

是從多個(gè)批次的胎牛血清篩選出特定批號(hào)，適用于人及小鼠胚胎干細(xì)胞,、成體干細(xì)胞及原代細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng),。

9,、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）專用血清

從多個(gè)批次的胎牛血清篩選出特定批號(hào)，經(jīng)過(guò)骨髓,，脂肪組織及臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性嚴(yán)格測(cè)試,，通過(guò)傳代及分化比例測(cè)試。

其他動(dòng)物血清

10,、馬血清

10%馬血清可代替FBS用于支持SRBC的體外抗體應(yīng)答, 常與牛血清結(jié)合或單獨(dú)作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的補(bǔ)充培養(yǎng)基,。

11、豬血清

豬血清在染色體研究中表現(xiàn)非常出色,，可用于淋巴細(xì)胞培養(yǎng), 疫苗生產(chǎn)（生產(chǎn)支原體）, 中和脂質(zhì)體包裹的腺相關(guān)病毒（AAV）, 用于誘導(dǎo)大鼠肝纖維化, 作為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）中的標(biāo)準(zhǔn)陰性參考,。

12、兔血清

正常兔血清可作為免疫分析的阻斷劑和對(duì)照,。在免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)方面,，各種研究均采用20%或1:200稀釋兔血清作為阻斷劑。

13,、羊血清

用于生物醫(yī)學(xué)研究的大多數(shù)細(xì)胞系和原代培養(yǎng)物上,，F(xiàn)BS的合適替代物，病毒分離和鑒定,，病毒學(xué)研究,。

用作魚類細(xì)胞培養(yǎng)的有效NBCS替代物。

可成功地代替胎牛血清在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中長(zhǎng)期用于環(huán)孢蘑菇的體外繁殖,。