小鼠結腸癌細胞穩(wěn)定表達熒光素酶，CT26+luc

細胞介紹：

CT26細胞是被N-亞硝基-N-甲基脲烷（NNMU）誘導得到的未分化的小鼠結腸癌細胞,，該細胞的一個克隆形成的細胞系被命名為CT26.WT,。CT26.WT被逆轉錄病毒載體LXSN穩(wěn)定轉化形成了一個致死性的亞克隆CT26.CL25，這一病毒載體含有lacZ基因,、編碼腫瘤相關抗原（TAA）和beta半乳糖苷酶,。CT26.WT和CT26.CL25細胞在小鼠中生長速度和致死率都很相似，不同的是CT26.CL25細胞可以表達腫瘤相關抗原和beta半乳糖苷酶,，因此這兩株細胞可以聯(lián)合用于免疫和宿主免疫反應的研究,。該細胞通過慢病毒轉染的方式攜帶Luc基因。

細胞特性

1） 來源：小鼠結腸

2） 形態(tài)：成纖維細胞樣,，貼壁生長

3） 含量：>1x10⁶  細胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用,。

細胞篩選：

該細胞為穩(wěn)定轉染Luc的細胞，隨細胞傳代次數(shù)的增加,，其Luc熒光強度會逐漸減弱,。若實驗要求需要維持熒光強度，可以加入嘌呤霉素進行再次篩選,。 建議收到細胞后至少傳3代,，凍存留種后再進行篩選。

初次進行細胞篩選時,，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的*培養(yǎng)基維持培養(yǎng),，若無細胞漂浮或者漂浮較少,，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的*培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推,，至最高藥物濃度為5ug/ml,。若篩選過程中，漂浮細胞大于60%,，則停止篩選,，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細胞密度約80%,，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進行篩選,。當加入5ug/ml嘌呤霉素時細胞正常增殖，可停止篩選,，用不含藥*培養(yǎng)基正常培養(yǎng),。

運輸和保存：干冰運輸及復蘇好存活細胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染,，請立即與我們聯(lián)系,。（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作,。

細胞接收后的處理：

1）收到細胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細胞有污染,，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài),，同時給剛收到的細胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù),。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況,。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下,，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL,，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中,，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收,。

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞,。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 ,。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清,，10%,；雙抗,，1%,。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,，95%,；二氧化碳,，5%,。 溫度：37℃,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3） 凍存液：90%血清,，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

二．細胞處理：

1） 凍存細胞的復蘇：：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液,，*培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜,。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間）,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化,。 

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行,。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例,；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中,，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度,。一般細胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min,，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ,，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中,，標注好名稱、代數(shù),、日期等信息,。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜,，之后轉入液氮容器中儲存,。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

小鼠結腸癌細胞穩(wěn)定表達熒光素酶,，CT26+luc 

注意事項：

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護,，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩,。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏,，并會慢慢充滿液氮。解凍時,，液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,，從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害。

★ 我們需要知道都有哪些種類的牛血清和它們的用途：

1,、透析血清

分子量小于10,000的分子如氨基酸,、葡萄糖、鹽離子和未結合的蛋白均被移除,。透析血清主要用在進行營養(yǎng)成分優(yōu)化和標定特定成分進行研究的實驗中,。

2、碳吸附血清

使用活性和右旋糖苷去除血清中的親脂類(lipophilic)物質，如某些激素,、細胞因子,、生長因子等，去除作用對分子量大小并無區(qū)分,。碳吸附胎牛血清常用于體外培養(yǎng)研究驗證激素的作用效果,。

3、去外泌體血清

適用于收集細胞分泌的外泌體時使用,。

4,、低IgG血清

用于研究抗體、病毒和病毒反應,、細胞表面抗原表位,。

5、四環(huán)素血清

應用于使用敏感四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)的細胞培養(yǎng)(Tet-on, Tet-off),，以及其它對四環(huán)素敏感的實驗中,。

6、IR (輻照)

鈷60伽馬輻照劑量在3.5Mrad. 通過直接與間接作用將生物大分子（如核酸）鍵結破壞,，人畜用藥物/疫苗,，及對微生物負荷(Bioburden)要求水平的實驗,。

7,、HI (熱滅活)處理血清

56℃, 30Min, 破壞補體，確保細胞與抗體結合不會發(fā)生裂解,。

8,、胚胎干細胞（ES）專用血清

是從多個批次的胎牛血清篩選出特定批號，適用于人及小鼠胚胎干細胞,、成體干細胞及原代細胞長期培養(yǎng),。

9、間充質干細胞（MSC）專用血清

從多個批次的胎牛血清篩選出特定批號,，經(jīng)過骨髓,，脂肪組織及臍帶來源的間充質干細胞的細胞活性嚴格測試，通過傳代及分化比例測試,。

其他動物血清

10,、馬血清

10%馬血清可代替FBS用于支持SRBC的體外抗體應答, 常與牛血清結合或單獨作為哺乳動物細胞培養(yǎng)的補充培養(yǎng)基。

11,、豬血清

豬血清在染色體研究中表現(xiàn)非常出色,，可用于淋巴細胞培養(yǎng), 疫苗生產（生產支原體）, 中和脂質體包裹的腺相關病毒（AAV）, 用于誘導大鼠肝纖維化, 作為酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）中的標準陰性參考。

12,、兔血清

正常兔血清可作為免疫分析的阻斷劑和對照,。在免疫組織化學和免疫細胞化學方面，各種研究均采用20%或1:200稀釋兔血清作為阻斷劑。

13,、羊血清

用于生物醫(yī)學研究的大多數(shù)細胞系和原代培養(yǎng)物上,，F(xiàn)BS的合適替代物，病毒分離和鑒定,，病毒學研究,。

用作魚類細胞培養(yǎng)的有效NBCS替代物。

可成功地代替胎牛血清在生長培養(yǎng)基中長期用于環(huán)孢蘑菇的體外繁殖,。