人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞

nk-92mi細胞

NK-92MI專用培養(yǎng)基

懸浮

淋巴母細胞樣 成團聚集

細胞傳代

18.細胞傳代的方法都有哪些,？

根據(jù)不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代,；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代,；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后,，再吹打,。

19.原代培養(yǎng)的傳代應注意的問題？

細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,，不要急于傳代,；原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長，不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時處理,，并根據(jù)不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞,；

吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷,；傳代時細胞接種數(shù)量要多一些,，使細胞能盡快適應新環(huán)境而利于細胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶,。

20.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的,？應如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和,，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+,、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素,。但EDTA單獨使用不能使細胞*分散,，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好,。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶,。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+,、Mg2+的BSS配置,。如果使用EDTA，在終止消化前,，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液,。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃,，避免反復冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低,，并可減少污染的機會。

21.欲將一般動物細胞離心下來,，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速,？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為800~1000 rpm,，5~10 分鐘,，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡,。

22.細胞的接種密度為何,？

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一,。

23.細胞交叉污染的可能原因,？

多種細胞系進行維持傳代操作時，各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開,，往往會使一種細胞被另一種細胞污染,。

細胞凍存

24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO,？

因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時，細胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶,，冰晶的形成將造成細胞損傷,，還可引起細胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護劑,。這兩種細胞無明顯毒性,，分子量小，溶解度大,，易穿透細胞,，可以使冰點下降，提高包膜對水的通透性,。

25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何,？ 

冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO,，其本身即為無菌狀況,，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃,，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì),，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO,，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜,。 

26.欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度,？ 

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細胞的方法,？ 

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存,。 

冷凍保存方法二：冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存,。–20 ℃ 不可超過 1 小時,，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中,，存活率稍微降低一些。

28.細胞凍存太多會不會浪費,？

每一種細胞系都應有充足的凍存儲備,，防止由于細胞污染等因素造成的細胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細胞狀態(tài)都不同，應該挑選幾個狀態(tài)較好的批次凍存保種,。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用最好凍存以免傳代太多,，造成細胞衰老或者發(fā)生改變。

人原代乳腺癌成纖維細胞永生化

人原代軟骨細胞永生化

人臍靜脈內(nèi)皮原代細胞+GFP 原代細胞+GFP

人神經(jīng)母細胞瘤細胞 sh-sy5y轉(zhuǎn)染突變型

人神經(jīng)母細胞瘤細胞 sh-sy5y轉(zhuǎn)染野生型

小鼠肺成纖維細胞永生化

小鼠附睪脂肪干細胞永生化

小鼠腎小球系膜細胞永生化

小鼠胰腺星狀細胞永生化

小鼠脂肪干細胞永生化

麝香鼠原代乳腺上皮細胞永生化

小鼠骨髓巨噬細胞永生化

小鼠角膜上皮細胞永生化

小鼠肝星狀細胞永生化

大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞永生化

大鼠內(nèi)皮祖細胞永生化

大鼠脂肪干細胞+RFP 原代細胞+RFP

雞胚成纖維細胞永生化

雞氣管黏膜上皮細胞永生化

鴨腦微血管內(nèi)皮細胞永生化

鴨胚成纖維細胞永生化 Duck embryo

鴨胚肝間質(zhì)細胞永生化

羊睪丸間質(zhì)細胞永生化

湖羊瘤胃上皮細胞永生化

山羊乳腺上皮細胞永生化

豬脂肪干細胞永生化

豬扁桃體上皮細胞永生化

豬肝星狀細胞永生化

豬骨骼肌衛(wèi)星細胞永生化

豬子宮內(nèi)膜上皮細胞永生化

豬鼻腔粘膜上皮細胞永生化

豬外周血單個核細胞（PBMC）永生化

豬主動脈內(nèi)皮細胞永生化

豬小腸上皮細胞永生化

雪貂鼻腔粘膜上皮細胞永生化

兔子宮內(nèi)膜上皮細胞永生化

兔肝臟間質(zhì)細胞永生化

nk-92mi細胞

01冷凍管應如何解凍,？
取出冷凍管后,，須立即放入37 °C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂,。

注：操作時戴好手套,，防止凍傷；帶上防護眼鏡可以防止液氮罐里剛剛拿出來的管子液氮爆炸……

復蘇過程應快融,，目的是防止小冰晶形成大冰晶,，即冰晶的重結(jié)晶。凍存細胞從液氮中取出后,，立即放入37℃水浴中,，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）,。解凍后的細胞可以直接接種到含有*培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng),，24小時后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO,。如果細胞對冷凍保護劑特別敏感,，解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,。

02細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,，是否應馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外,，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）,，在解凍之后，可直接放入10-15ml新鮮培養(yǎng)基,，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可,，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

03細胞培養(yǎng)時能否更換培養(yǎng)基種類,？
首先得確定現(xiàn)在用的培養(yǎng)基是否適合您的細胞生長,。細胞培養(yǎng)過程中，細胞增殖和形態(tài)正常的情況下最好不要更換培養(yǎng)基，細胞都有各自適應的培養(yǎng)基,，更換培養(yǎng)條件,，細胞可能無法快速適應，導致細胞死亡,。若必須更換,，可嘗試半換，讓細胞逐漸適應新的培養(yǎng)基,。

更換培養(yǎng)基的方法：如果是貼壁生長的細胞,， 一般可以直接把培養(yǎng)液吸掉， 再加入新的,。加的時候注意不要對著長細胞的那一面,。如果是懸浮型的， 就需要低速離心 （把所有的細胞和培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管里,， 或有些離心機配有直接離心細胞培養(yǎng)皿的裝置）,， 然后再吸掉上清液。加入新的培養(yǎng)液使細胞重新懸浮,。

04細胞培養(yǎng)時能否更換胎牛血清,？
首先要確定更換胎牛血清的理由，如果細胞培養(yǎng)無異常的話,，不建議隨意更換不同品牌和來源的胎牛血清,。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的來源（血源地）和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響,。來自不同地域和等級的血清,，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞死亡,。如果是使用的胎牛血清出現(xiàn)了問題,，比如保存不當或操作不當導致血清成分析出、混濁,、污染等情況,，可以優(yōu)先更換同品牌、等級,、批次的血清,。如果是產(chǎn)品質(zhì)量問題更換血清品牌的話，需要用一批細胞進行預實驗才行,，以保證細胞能夠正常培養(yǎng),。另外大家在購買胎牛血清的時候要選擇正規(guī)來源，非正規(guī)來源的胎牛血清有很多安全隱患,，對實驗室,、操作人員,、細胞培養(yǎng)、實驗數(shù)據(jù)都有很大的影響,。
05培養(yǎng)細胞時應使用多少濃度的二氧化碳,？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO₂濃度,。當培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時,，細胞培養(yǎng)時應使用10%CO₂；當培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時,，則應使用5% CO₂培養(yǎng)細胞,。

06一般在拿到細胞后，應該注意什么,？

收到細胞后先不要開蓋,，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時后（看細胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議對收細胞時的培養(yǎng)基拍一張照片,，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況,，顯微鏡下拍細胞100X，200X各一張）,，排除細胞本身污染的情況；收到細胞未開封,，出現(xiàn)污染狀況一般可以再申請免費發(fā)送一株細胞,。

收到細胞時如無異常情況，請在顯微鏡下觀察細胞密度,，如為貼壁細胞,，未超過80%匯合度時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出,，留下10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),；超過80%匯合度時，請按細胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng),。如為懸浮細胞,，吸出培養(yǎng)液、1000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,，吸出上清,，管底細胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細胞后移回培養(yǎng)瓶。

細胞消化液建議使用PBS配制,，慎用Hanks液配制,。