細胞名稱：狗腎轉(zhuǎn)化細胞

MDCK

細胞培養(yǎng)條件：MEM+10%FBS+1%P/S  

生長狀態(tài)：貼壁生長

細胞是生物學實驗的重要材料,，也是生物細胞學實驗的基礎,，藥物,、基因功能、疾病機理等的相關研究多數(shù)需要在細胞水平進行闡釋,。而細胞培養(yǎng),，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大,，在細胞培養(yǎng)中常常會遇到很多的細節(jié)問題，而每個問題都有可能導致細胞培養(yǎng)的失敗,。我們匯總了細胞實驗室多年來的細胞培養(yǎng)經(jīng)驗分享給大家,，希望能給大家的細胞培養(yǎng)帶來幫助,。

一．細胞系身份需明確

我們之所以選定某種細胞系開展實驗,，是因為所選細胞系的一些特性符合研究方向的設定,。比如組織特性,，疾病特性,，功能特性,，基因表達特性等,。一旦用錯了細胞株，對我們研究結果的判斷就會帶來很大的誤差和不確定性,。

而近年來,，多個機構發(fā)現(xiàn)細胞系在培養(yǎng)和流通過程中，出現(xiàn)了很嚴重的交叉污染。據(jù)不*統(tǒng)計,，單就HeLa細胞系導致的污染致使3萬多篇論文結果的準確性存在問題（doi:10.1371/journal.pone.0186281）,。而這種情況不僅僅限于HeLa細胞,。多個機構研究人員檢測發(fā)現(xiàn)超過451個細胞系已被其它細胞*吸收,，在所檢測細胞中污染占比46%，可見細胞交叉污染的現(xiàn)象非常普遍,。因此，做實驗前對細胞株驗明正身非常重要,。如果是在機構購買的細胞株，最好能讓供方提供合格的STR鑒定報告,。

目前,，STR基因分型方法是進行細胞交叉污染和性質(zhì)鑒定的*和準確的方法之一，是ATCC等機構認定的金標準,。不過可惜的是并非所有細胞均可進行STR鑒定,，目前只有大部分的人源細胞株和45個種類的小鼠細胞株可以進行鑒定。其他細胞株可以結合細胞形態(tài),、特性和物種鑒定來進行確認。

二．培養(yǎng),、傳代,、凍存和復蘇

1.準備工作：

根據(jù)培養(yǎng)細胞的特性,，提前準備好適合的培養(yǎng)基和血清等。最好沿用細胞原來的培養(yǎng)條件,，以免細胞在新環(huán)境下還需要過渡適應,。同時，充分了解到細胞的生長特性和形態(tài)特征,，便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。

2.貼壁細胞傳代：

1）移棄使用過的細胞培養(yǎng)液,。（不要直接倒掉,，避免瓶口殘留導致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的PBS沖洗細胞,。從與貼壁細胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層,，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液,。（洗去殘留的血清，避免影響活性,。）

3）以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例,，向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白mei-EDTA（請根據(jù)各細胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶,，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育,。通常,，幾分鐘內(nèi)，會發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮,、細胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時細胞層能自然流下，此時應加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化（細胞解離所需時間請參考各細胞的指引,，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況）,。另外，并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白mei進行解離,，請根據(jù)各細胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養(yǎng)瓶傾斜,，吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細胞生長表面,，重復該動作2-3次,，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個懸液（吹打過程中應避免氣泡的產(chǎn)生）,。

PS：對于難消化的細胞,，盡量不要通過用力吹打的方式來處理,，以免對細胞產(chǎn)生物理損傷,?？梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細胞分出來,，及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化,。做到分層消化,，避免易消化細胞長時間在消化下受損,。

5）把所有的細胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清,。

6）加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細胞懸液,。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補足新的含血清*培養(yǎng)液,，輕輕搖晃混勻,。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況,。

3.懸浮細胞傳代：

因懸浮生長細胞不貼壁，故傳代時不必采用酶消化方法,，而可直接傳代或離心收集細胞后傳代,。

1）直接傳代時，靜置5-10分鐘,，待懸浮細胞慢慢沉淀到器皿底部后,，吸掉1/2-2/3原培養(yǎng)液,，補足新鮮的含血清*培養(yǎng)液，混勻成細胞懸液,。按各細胞指引推薦的傳代比例,，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，輕輕搖晃混勻,。

2）離心傳代時，將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),，800-1000rpm離心3-5分鐘,，移棄上清后,，加入新鮮的含血清*培養(yǎng)液重懸。按各細胞指引推薦的傳代比例,，把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,，補足新鮮的含血清*培養(yǎng)液,，輕輕搖晃混勻。

3）放到37 ℃ 孵育,，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況,。

4.貼壁懸浮混合型細胞傳代：

先將懸浮的細胞收集,，再參考“貼壁細胞傳代"方法進行消化收集，一起接種到培養(yǎng)器皿中,。

PS: 懸浮細胞生長中一般對細胞密度要求比較高,，培養(yǎng)中最好參考指南控制好細胞密度，不能過密也不能過稀,。

5.細胞凍存：

1）按照“細胞傳代步驟"中的方法收集細胞,。

2）加入細胞凍存液（一般10%DMSO+對應細胞的*培養(yǎng)液），使細胞的終密度為(5~10)×105個/ml,，移入細胞凍存管中。

3）程序降溫（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例）：4℃ 30min→-80℃過夜→液氮,。（一定不能省略4℃的30min,，否則凍存液無法滲透到細胞,，易產(chǎn)生冰晶導致細胞受損。）

6.細胞復蘇：

1）取出貯存的細胞,，待液氮揮發(fā)后,，馬上37℃水浴中輕輕搖動使快速融化（通常2min內(nèi),，時間長了細胞狀態(tài)會受影響）。為避免劇烈的溫差變化導致凍存管炸裂,，操作該步時請配戴防護面罩或防護目鏡,。

PS：干冰運輸?shù)膬龃婕毎?，收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中，至?d后再進行復蘇操作,。

2）轉(zhuǎn)移到無菌操作臺,，75%酒精擦拭凍存管外部。

3）將細胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10-20ml經(jīng)預熱的含血清*培養(yǎng)液離心管中,，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清,。

4）重新加入經(jīng)預熱的含血清*培養(yǎng)液重懸細胞，以約(3~5)×105個/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中,。

5）放到37℃孵育,，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況,。

狗腎轉(zhuǎn)化細胞

三.污染防治

1.細菌污染

細菌污染是細胞培養(yǎng)中最常見的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入,。最常見的有枯草桿菌,、大腸桿菌,、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態(tài)則為長桿狀,、短桿狀和顆粒狀等,。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內(nèi)即可使培養(yǎng)基渾濁,；厭氧菌在常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下增殖緩慢，需要較長時間才會觀察到渾濁現(xiàn)象,。

污染處理：由于國內(nèi)細胞培養(yǎng)中抗生素使用泛濫,，所以出現(xiàn)污染后加雙抗（Penicillin + Streptomycin）一般沒有效果,。桿菌可選用100ug/ml慶大霉su處理一周，顆粒狀細菌可用25ug/ml環(huán)丙沙xing處理一周,，效果相對還不錯,。

2. 真菌污染

細胞培養(yǎng)中最常見的污染真菌有：煙曲霉,、黑曲菌、毛霉菌,、白色念珠菌,、酵母菌等。

左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片,，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態(tài),。

污染處理：可用100ug兩性霉素/T25瓶,，處理一周,。

注：性較大，需要在細胞有50%以上且狀態(tài)沒受大影響前處理,。