類(lèi)器官是能夠在體外三維培養(yǎng),，并表現(xiàn)出相應(yīng)器官生物學(xué)特征的“最小系統(tǒng)",。隨著類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步,，應(yīng)用也越來(lái)越廣泛,。關(guān)于類(lèi)器官構(gòu)建原理,、培養(yǎng)等方面的問(wèn)題解答，希望能夠?qū)Ω魑恍』锇橛兴鶐椭?/span>

基礎(chǔ)篇

Q1: 類(lèi)器官培養(yǎng)對(duì)于起始細(xì)胞的來(lái)源有要求嗎,？

A1: 目前培養(yǎng)的類(lèi)器官主要來(lái)源于上皮細(xì)胞,，對(duì)于非上皮細(xì)胞來(lái)源的類(lèi)器官培養(yǎng)方式還需要進(jìn)一步研究。

Q2: 類(lèi)器官按照起始細(xì)胞的類(lèi)型,，分為幾種呢,？

A2: 常見(jiàn)的類(lèi)器官根據(jù)起始細(xì)胞的類(lèi)型，可以分為兩種：

（1）腫瘤組織來(lái)源的腫瘤類(lèi)器官,；

（2）干細(xì)胞來(lái)源的類(lèi)器官,，包括：多能性干細(xì)胞 (PSC) /成體干細(xì)胞 (ASC)以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)。

Q3: 類(lèi)器官是由單一種類(lèi)細(xì)胞組成的嗎,？

A3: 類(lèi)器官并不是單一細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu),，而是由具有干細(xì)胞性質(zhì)的起始細(xì)胞進(jìn)行分裂和分化，并將多種類(lèi)型的細(xì)胞自組裝的結(jié)構(gòu),，自組裝后的形態(tài)和功能與體內(nèi)相應(yīng)器官相似,。

Q4：在沒(méi)有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織提取的原代細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)嗎,？

A4：可以的,。已有學(xué)者驗(yàn)證過(guò)，將人結(jié)腸癌,、甲狀腺癌,、肺癌、腎癌和肝癌的手術(shù)組織切碎后,，以梯度降溫的方式進(jìn)行冷凍,，最終在液氮中保存15-18個(gè)月后進(jìn)行復(fù)蘇和原代細(xì)胞提取，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2D和3D培養(yǎng),，證實(shí)了凍存對(duì)于細(xì)胞活力和生長(zhǎng)速度均無(wú)顯著影響^【1】,。

當(dāng)然，由于組織來(lái)源不同,、凍存條件不同,，還需要大家根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行驗(yàn)證，新鮮組織提取的細(xì)胞依然是3D培養(yǎng)的選擇,。

Q5：類(lèi)器官可以像細(xì)胞一樣進(jìn)行凍存和復(fù)蘇嗎,？

A5：類(lèi)器官可以?xún)龃妫ǔ?huì)在傳代2-3次之后選擇凍存,。為了達(dá)到最佳的效果,，可以選擇類(lèi)器官成熟（傳代7-10次）后再進(jìn)行凍存,。

Q6：類(lèi)器官的尺寸需要進(jìn)行控制嗎？

A6：是的,，主要的原因是類(lèi)器官內(nèi)部缺乏循環(huán)系統(tǒng),。

當(dāng)類(lèi)器官的尺寸較大時(shí)，靠近中心的細(xì)胞難以和外界進(jìn)行氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分的交換,。因此這個(gè)結(jié)構(gòu)尺寸越大,，死亡的細(xì)胞就越多（如圖1）^【2】。我們?cè)谂囵B(yǎng)的過(guò)程中,，需要控制類(lèi)器官的大小在4-5mm以?xún)?nèi),。未來(lái)的類(lèi)器官技術(shù)可以與血管類(lèi)器官結(jié)合在一起，建立一個(gè)功能性的封閉循環(huán)系統(tǒng),，用以培養(yǎng)出更大尺寸的類(lèi)器官,。

圖1. TUNEL染色表明較大尺寸的類(lèi)器官中心有大量細(xì)胞死亡（綠色），比例尺為100μm^【2】

Q7：類(lèi)器官傳代的標(biāo)準(zhǔn)是什么,？

A7：類(lèi)器官的傳代通常是根據(jù)培養(yǎng)的時(shí)間判斷,。一般在7-14天時(shí)進(jìn)行第一次傳代，后續(xù)則每7-10天傳代一次^【3】,。

Q8：類(lèi)器官可以進(jìn)行多少次傳代,？

A8：大部分類(lèi)器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個(gè)月），甚至有些類(lèi)器官可以連續(xù)傳代20次（>12個(gè)月）并且維持原有的生長(zhǎng)速度^【4】,。

Q9: 鑒定類(lèi)器官的方法有哪些,？

A9: 初步可以通過(guò)顯微鏡和H&E染色觀察形態(tài)；然后可以用Western Blot,、qRT-PCR,、免疫熒光,、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該類(lèi)器官是否表達(dá)相應(yīng)的biomarker,；基因測(cè)序可以鑒定所培養(yǎng)的類(lèi)器官是否有某些特征丟失；對(duì)于部分類(lèi)器官,，還可以檢測(cè)其是否具有功能,，例如：已有研究檢測(cè)出胃類(lèi)器官可以分泌胃酸，心臟類(lèi)器官可以自主跳動(dòng),。

Q10: 類(lèi)器官是如何按照我們的意愿進(jìn)行定向分化的,？

A10: 在進(jìn)行類(lèi)器官培養(yǎng)前，我們需要了解該器官在體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程,，及早期發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路,。

以胃類(lèi)器官培養(yǎng)為例：胃由前后腸發(fā)育而來(lái)，早期發(fā)育需要由多種信號(hào)通路共同調(diào)控,。那么在體外我們需要通過(guò)添加細(xì)胞因子的方式,，指導(dǎo)激活/抑制相應(yīng)的信號(hào)通路,，來(lái)達(dá)到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內(nèi)胚層,，Wnt3a,、FGF-4和Noggin指導(dǎo)細(xì)胞向向前腸分化^【5】。

問(wèn)：類(lèi)器官原代培養(yǎng)的挺好的,，一傳代就不行了是什么原因,？

答：可能是傳代過(guò)程有樣本的丟失，因?yàn)榛|(zhì)膠重選后還是會(huì)有一些類(lèi)器官在膠里,，傳代的時(shí)候可以不用把基質(zhì)膠wan全去除干凈,，留一點(diǎn)。

問(wèn)：除了T細(xì)胞,，類(lèi)器官還可以和哪些細(xì)胞共培養(yǎng),？

答：還可以和PBMC、成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)

問(wèn)：類(lèi)器官?gòu)?fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)是什么,？

答：類(lèi)器官?gòu)?fù)蘇后,，培養(yǎng)1周左右，可以正常進(jìn)行傳代說(shuō)明復(fù)蘇效果比較好,。

問(wèn)：類(lèi)器官凍存的標(biāo)準(zhǔn)是什么呢,？?jī)龃嫘枰嗌兕?lèi)器官？

答：前5代建議是取2-3孔凍存為1管,，1孔大概是20個(gè)類(lèi)器官左右,。

問(wèn)：類(lèi)器官鑒定的方法有哪些？

答：鑒定方式一是可以從組織層面進(jìn)行,，主要是組化鑒定,；另外是分子層面，可以進(jìn)行外顯子測(cè)序或者轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等測(cè)序手段,。

問(wèn)：類(lèi)器官培養(yǎng)成功的標(biāo)準(zhǔn)是什么呢,？

答：目前還沒(méi)用一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，一般類(lèi)器官可以穩(wěn)定傳代3代以上,，說(shuō)明干性是比較好的,。

問(wèn)：類(lèi)器官長(zhǎng)到多大可以做藥篩呢？

答：一般傳代后長(zhǎng)到200-300um可以進(jìn)行藥篩實(shí)驗(yàn)

問(wèn)：一個(gè)類(lèi)器官試劑盒 可以養(yǎng)多少個(gè)類(lèi)器官,？

答：2-4個(gè),，100ml的培養(yǎng)基可以養(yǎng)200個(gè)孔。

問(wèn)：類(lèi)器官可以直接用細(xì)胞系培養(yǎng)嗎?

答：用細(xì)胞系培養(yǎng)的不能成為類(lèi)器官,，只能稱(chēng)之為細(xì)胞球,。

問(wèn)：取材時(shí)為什么剔除脂肪組織？脂肪肝可以做類(lèi)器官培養(yǎng)嗎,？

答：脂肪組織影響后續(xù)消化分離得到的干細(xì)胞純度,，脂肪肝也是可以做類(lèi)器官培養(yǎng)的,，消化前可以多清洗幾次，去掉表面脂肪,。

問(wèn) ：類(lèi)器官培養(yǎng)一定需要基質(zhì)膠嗎,？

答：基質(zhì)膠主要是為類(lèi)器官提供支撐作用和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)膠主要成分有l(wèi)aminin,，collagen IV,，heparan sulfate proteoglycans。

問(wèn)：如果要做藥篩需要額外去除基質(zhì)膠和培養(yǎng)基嗎,？

答：和傳代培養(yǎng)鋪板一樣,，藥用培養(yǎng)基稀釋就可以。

問(wèn)：類(lèi)器官量多小的時(shí)候不需要加消化液,？

答：一般是100um以下,。

問(wèn)： 想要CTC培養(yǎng)，需要多少樣本量呢,？

答：至少50+個(gè)CTC,，取樣時(shí)可以多取一些血，CTC細(xì)胞占比比較少,。

問(wèn)：原代培養(yǎng)中消化下來(lái)的細(xì)胞是只有干細(xì)胞嗎,？

答：消化下來(lái)的細(xì)胞包含各個(gè)種類(lèi)的細(xì)胞，但是能培養(yǎng)成類(lèi)器官的只有成體干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞,，沒(méi)有干性的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)增殖分化,，養(yǎng)的過(guò)程會(huì)死掉。

問(wèn)：初始量樣本量10*5,，活性大于90%,，可以培養(yǎng)出多少類(lèi)器官？

答：培養(yǎng)一代,，一般是24孔板的10個(gè)孔,。

問(wèn)： 類(lèi)器官培養(yǎng)一代需要多長(zhǎng)時(shí)間？

答 ：一般需要5-7天,，長(zhǎng)得快可3-5天,。