1、瘤細胞懸液接種

（1）無菌選取生長良好(有光澤,，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細胞,。

（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過濾成細胞懸液,。

（3）培養(yǎng)細胞應(yīng)用PBS洗兩遍,。

（4）計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至107～108／ml。

（5）常規(guī)消毒后,，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml／部位,，＞106細胞)。初次接種成功率低,，細胞數(shù)盡可能多一些,。

（6）次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期,，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短,，最后固定為一個相對穩(wěn)定的時間。

2,、腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔,、腹壁或其他部位，引起腹水,，腹水中含有瘤細胞,，將這種腹水反復(fù)傳代，即可成為腹水瘤,。初次傳代時,，腹水常呈血性(含大量紅細胞)，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下,。

（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細胞離心和洗滌,，進行細胞計數(shù)。

（2）消毒動物,，左下腹穿刺接種106腹水瘤細胞,。

（3）接種腹水瘤細胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大,。用碘酒棉球消毒小鼠腹部,，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后,，用滴管吸取,。每只小鼠可抽3~5ml。

（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min,，收集上清,，分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>

1,、凍存細胞：

（1）選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染),，在凍存前1d換液。

（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液,，計數(shù),，使細胞密度達5×107／ml左右密度，離心,，去上清,。

（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml,，DMSO 1ml,，5.6%NaHCO3 0.1ml）,，按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸,。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,，可使冰點降低，使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外,。

（4）分裝于無菌凍存管中,，每管加1.5m懸液。

（5）旋好凍存管并仔細檢查,，一定要蓋緊,，做好標記。

（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中,，按-1℃／min的速度,，在30～40min時間內(nèi)，下降到液氮表面,，再停30min后,，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度,，過快能影響細胞內(nèi)水分透出,，太慢則促進冰晶形成。

操作時應(yīng)戴防護眼鏡和手套,，以免液氮凍傷,。

2、復(fù)蘇細胞：

（1）從罐中取出凍存管,。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴,，不時搖動，使其急速融化,，30～60s內(nèi)完成,。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子,，用吸管將細胞懸液注入離心管中,，再滴加10ml培養(yǎng)液。

（4）低速離心(500～1000r／min) 5min,，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次,。

（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng),，次日更換一次培養(yǎng)液后,，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。

凍存細胞數(shù)量要充分,，密度應(yīng)達到107／ml,，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數(shù)量,。