1,、瘤細(xì)胞懸液接種

（1）無菌選取生長良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細(xì)胞,。

（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨,，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過濾成細(xì)胞懸液。

（3）培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用PBS洗兩遍,。

（4）計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至107～108／ml,。

（5）常規(guī)消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細(xì)胞懸液(0.1ml／部位,，＞106細(xì)胞),。初次接種成功率低，細(xì)胞數(shù)盡可能多一些,。

（6）次日注意觀察動物一般情況,。初次接種一般有一段較長的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短,，最后固定為一個相對穩(wěn)定的時間,。

2、腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實體瘤細(xì)胞直接種于小鼠腹腔,、腹壁或其他部位,，引起腹水，腹水中含有瘤細(xì)胞,，將這種腹水反復(fù)傳代,，即可成為腹水瘤。初次傳代時,，腹水常呈血性(含大量紅細(xì)胞),，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下,。

（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細(xì)胞離心和洗滌,，進行細(xì)胞計數(shù),。

（2）消毒動物，左下腹穿刺接種106腹水瘤細(xì)胞,。

（3）接種腹水瘤細(xì)胞后約7~12d,，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部,，用9號針頭抽取腹水,，也可行腹部解剖后，用滴管吸取,。每只小鼠可抽3~5ml,。

（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min，收集上清,，分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>

1、凍存細(xì)胞：

（1）選對數(shù)增生期細(xì)胞(證明無支原體污染),，在凍存前1d換液,。

（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計數(shù),，使細(xì)胞密度達5×107／ml左右密度,，離心，去上清,。

（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml,，小牛血清2ml，DMSO 1ml,，5.6%NaHCO3 0.1ml）,，按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,，可使冰點降低,，使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。

（4）分裝于無菌凍存管中,，每管加1.5m懸液,。

（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊,，做好標(biāo)記,。

（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,，在30～40min時間內(nèi),，下降到液氮表面，再停30min后,，直接投入液氮中,。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,，太慢則促進冰晶形成,。

操作時應(yīng)戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷,。

2,、復(fù)蘇細(xì)胞：

（1）從罐中取出凍存管。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴,，不時搖動,，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成,。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后,，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中,，再滴加10ml培養(yǎng)液,。

（4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次,。

（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后,，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后,，繼續(xù)培養(yǎng),。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。

凍存細(xì)胞數(shù)量要充分,，密度應(yīng)達到107／ml,，在融后稀釋20倍時,，仍能保持5×105／ml數(shù)量。