小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶

(CT26+luc)

細(xì)胞介紹：

CT26細(xì)胞是被N-亞硝基-N-甲基脲烷（NNMU）誘導(dǎo)得到的未分化的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞,，該細(xì)胞的一個克隆形成的細(xì)胞系被命名為CT26.WT,。CT26.WT被逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN穩(wěn)定轉(zhuǎn)化形成了一個致死性的亞克隆CT26.CL25，這一病毒載體含有lacZ基因,、編碼腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和beta半乳糖苷酶,。CT26.WT和CT26.CL25細(xì)胞在小鼠中生長速度和致死率都很相似，不同的是CT26.CL25細(xì)胞可以表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原和beta半乳糖苷酶,，因此這兩株細(xì)胞可以聯(lián)合用于免疫治療和宿主免疫反應(yīng)的研究,。該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因。

細(xì)胞特性

1） 來源：小鼠結(jié)腸

2） 形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣,，貼壁生長

3） 含量：>1x10⁶ 細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5) 用途：僅供科研使用,。

細(xì)胞篩選：

該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Luc的細(xì)胞，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,，其Luc熒光強(qiáng)度會逐漸減弱,。若實(shí)驗要求需要維持熒光強(qiáng)度，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選,。 建議收到細(xì)胞后至少傳3代,，凍存留種后再進(jìn)行篩選。

初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時,，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的*培養(yǎng)基維持培養(yǎng),，若無細(xì)胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的*培養(yǎng)基繼續(xù)篩選,，以此類推,，至最高藥物濃度為5ug/ml。若篩選過程中,，漂浮細(xì)胞大于60%,，則停止篩選，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng),，至細(xì)胞密度約80%,，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選。當(dāng)加入5ug/ml嘌呤霉素時細(xì)胞正常增殖,，可停止篩選,，用不含藥*培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸,，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,，請立即與我們聯(lián)系,。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作,。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會因振動脫落和脫落后成團(tuán)的情況,。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下,，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL,，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理,。傳代過程中,，若因運(yùn)輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基,；優(yōu)質(zhì)胎牛血清,，10%,；雙抗,，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,，95%,；二氧化碳，5%,。 溫度：37℃,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

二．細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液，*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜,。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間）,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3.輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中,，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行,。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗使用,。下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中,，可使用血球計數(shù)板計數(shù),，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min,，去掉上清,。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中,，標(biāo)注好名稱,、代數(shù),、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中,，-80度冰箱中過夜,，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用,。

注意事項：

1. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù),，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩,。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏,，并會慢慢充滿液氮。解凍時,，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。