如何鑒定提取出來的外泌體？

以目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品,，也沒有任何一個單一實驗可以確定外泌體的存在,。根據(jù)國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會發(fā)表的指導(dǎo)手冊《MISEV 2018》，外泌體特征鑒定通過NTA測粒徑分布,、TEM電鏡分析形態(tài),、WB檢測標(biāo)志蛋白三項來驗證。NTA分析樣品中外泌體的粒徑分布和顆粒濃度,，TEM電子顯微鏡來觀察樣品中外泌體的形態(tài)特征,，WB檢測外泌體標(biāo)志蛋白,。

外泌體如何保存？

不同時間,、溫度的保存對不同的外泌體樣本影響不一,；如果研究方向為外泌體形態(tài)特征、蛋白或其他功能性分析,，在分離后新鮮使用為最佳,。目前主流的建議是提取出外泌體后最好是新鮮使用，或低溫短期保存,。

短時間幾天內(nèi)可以放4°C,，長時間儲存置于-80°C保存。

NTA檢測可以進(jìn)行外泌體定量嗎,？

NTA是物理方法,，基于顆粒的布朗運(yùn)動，因為不管是脂質(zhì)體,、蛋白,，甚至是PBS中的顆粒（部分實驗室自行配置的PBS中發(fā)現(xiàn)大量顆粒，推薦在外泌體研究中,，用VC品牌的PBS（P/N:C3580-0500）,，避免干擾），都會被軟件讀取,，并不能分辨是否為外泌體,。但NTA提供的粒徑分布可供判斷所提取的內(nèi)含物是否在外泌體的粒徑范圍內(nèi)；另外,，在做外泌體分泌的對比實驗中,，NTA提供的濃度值也可以作為重要的參考數(shù)據(jù)。

外泌體NTA檢測需要多少量,？

Zetaview儀器的最佳檢測區(qū)間是10^7 particles/ml,，且有濃度檢測下限，為10^5 particles/ml,，一般進(jìn)樣量不少于2 ml,；

無法準(zhǔn)確建議送樣量，檢測需要量與樣本本身濃度有關(guān),，樣本濃,，則用量小，反之則多,，根據(jù)檢測經(jīng)驗,，樣本取用量一般在2 µl-100 µl不等，取用量大于50 µl時大多由于樣本分泌量過低、提取失敗或者對樣本有過多稀釋,。

一般建議：送樣量不低于30 µl,。

外泌體用什么分離方法比較好？

無法明確哪種分離方法比較好,，各有千秋,，以下列出常用的外泌體分離方法：

超速離心法（差速離心和密度梯度離心）：操作繁瑣，耗時長,，分離外泌體純度較高,，但得率低，目前分離外泌體主流方法,；

尺寸排阻色譜（Size-exclusion chromatography，SEC）：應(yīng)用填充多孔聚合物微球的柱子,，精確分離大小分子,，操作簡便，耗時短,，分離外泌體純度較高,；

聚合物沉淀法：操作簡便，耗時短,，可能會同時分離非囊泡污染物（包括脂蛋白）,，分離外泌體純度較低；

磁珠免疫法：通過特定的抗體組合從樣本中捕獲不同類型的外泌體,，免疫親和技術(shù)具有高特異性,、可獲得高純度的外泌體、且不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn),，是富集表征*的外泌體的優(yōu)選方法,。但是此方法效率低，外泌體內(nèi)含物的生物活性易受pH和鹽濃度影響,，不利于下游實驗的進(jìn)行,。

組合方法：如聚合物沉淀法+SEC (CellGS Exo-spin 外泌體純化試劑盒）純化流程溫和，無需高速離心,，操作簡便并且產(chǎn)物純度高,，分離出的外泌體完好無缺，適用于下游功能研究,、WB驗證,、RNA分析等。