酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) ELISA

    一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA）是在免疫酶技術(shù)（immunoenzymatic techniques）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù),ELISA過程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被,，加待測抗體（抗原）, 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）--待測抗體（抗原）--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物,。借助分光光度計的光吸收計算抗體（抗原）的量,。待測抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)生成正比,。


    二．實(shí)驗(yàn)原理
    用于免疫酶技術(shù)的酶有很多,，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶,，葡萄糖氧化酶,，碳酸酐酶,，乙酰膽堿酯酶,，6－磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶,，堿性磷酸酯酶等,，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng),，在呈色后須立刻測定,，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準(zhǔn)確地定量,。 
     辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白,，每個分子含有一個氯化血紅素（protonhemin）區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示,。氯化血紅素輔基的大吸收峰是403nm,，HRP酶蛋白的大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25,，式中1％指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g,，即10mg/ml，所以,，酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP純度（RZ）=A403nm/A275nm純度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少,。高純度HRP的RZ值在3.0左右，可達(dá)3.4,。用于ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上,。 

   ELISA的基本原理有三條： 
    （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,，并保持其免疫學(xué)活性,；
    （2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性,； 
    （3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的,，因此,，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。 
    ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù),，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病,、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷,。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定,，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果,，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異,、簡單,、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點(diǎn),。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查,，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查,。本法不僅可以用來測定抗體,，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法,。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大,，可概括四個方面： 1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位,。 2,、研究抗酶抗體的合成。 3,、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng),。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份,。

基本方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml,。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜,。次日,，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次,，每次3分鐘,。（簡稱洗滌，下同）,。 
　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,，置37℃孵育1小時。然后洗滌,。（同時做空白孔,，陰性對照孔及陽性對照孔）。 
　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml,。37℃孵育0.5～1小時，洗滌,。 
　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,，37℃10～30分鐘,。 
　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 
　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上,，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺,，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”、“-”號表示,。也可測O•D值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處,，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O•D值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性,。 

基本方法二　用于檢測未知抗體的間接法： 
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml,， 每孔加0.1ml，4℃過夜,。次日洗滌3次,。 
↓ 
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白,、陰性及陽性孔對照） 
↓ 
于反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘,，洗滌,后一遍用DDW洗滌,。 
↓ 
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5,、6,。 

     （二） 酶與底物
    酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑,，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng),，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用,，但不同的酶選用不同的底物,。
免疫技術(shù)常用的酶及其底物

酶        底物        顯色反應(yīng)        測定波長
辣根過氧化物酶        鄰苯二胺        橘紅色        492*
        四甲替聯(lián)苯胺        黃色        460**
        氨基水楊酸        棕色        449
        鄰聯(lián)苯甲        蘭色        425
        2,2'-連胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）銨鹽        藍(lán)綠色        642
堿性磷酸酯酶        4-硝基酚磷酸鹽（PNP）        黃色        400
        萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽        紅色        500
葡萄糖氧化酶        ABTS+HRP+葡萄糖        黃色        405,420
        葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭        深藍(lán)色        
β-Ｄ－半乳糖苷酶        甲基傘酮基半乳糖苷（4MuG）        熒光        360,450
        硝基酚半乳糖苷（ONPG）        黃色        420


     *  終止劑為2mol/L H2SO4
     ** 終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑,。
     可催化下列反應(yīng)： HRP+H2O2→復(fù)合物 復(fù)合物+AH2→過氧化物酶+H2O+A AH2 ——為無色底物, 供氫體,； A—— 為有色產(chǎn)物。

（三） ELISA常用的四種方法

    1．直接法測定抗原 
      將抗原吸附在載體表面；
      加酶標(biāo)抗體,，形成抗原—抗體復(fù)合物,；
      加底物。底物的降解量＝抗原量,。 

     2．間接法測定抗體
     將抗原吸附于固相載體表面；
      加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物,；
      加酶標(biāo)抗體,；
      加底物。 測定底物的降解量＝抗體量,。

    3．雙抗體夾心法測定抗原
     將抗原免疫一種動物獲得的抗體吸附于固相表面;
     加抗原,，形成抗原-抗體復(fù)合物; 
     加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物;
     加酶標(biāo)抗抗體（第二種動物抗體的抗體）; 
     加底物,。底物的降解量＝抗原量,。

    4. 競爭法測定抗原
    將抗體吸附在固相載體表面;
     （1） 加入酶標(biāo)抗原；
     （2）,（3）加入酶標(biāo)抗原和待測抗原,；
     加底物,。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 

    三．儀器和材料

    1. 聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板（平板, 40, 96孔）,。
    2. 酶聯(lián)免疫檢測儀
    3. 辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀釋度1:1000,。
    4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml,。
     5. 稀釋液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃,，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸餾水加至1000ml,。
     6. 洗滌液：同稀釋液
     7. 封閉液：0.5%雞卵清蛋白,，pH7.4 PBS。
     8. 鄰苯二胺溶液（底物）：臨用前配制 0.1M 檸檬酸（2.1g/100ml）, 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O?。?.163g/100ml）　6.4ml, 蒸餾水12.5ml, 鄰苯二胺10mg, 溶解后, 臨用前加30%H2O2 40 微升,。
     9. 終止液：2mol/LH2SO4。 

    四.  操作步驟
    1. 包被抗原：用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋, 一般為1～10微克/孔,，每孔加200微升,，37℃溫育1小時后，4℃冰箱放置16～18小時,。
    2. 洗滌：倒盡板孔中液體,，加滿洗滌液，靜放三分鐘,，反復(fù)三次,，后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。
   3. 加封閉液200微升,，37℃放置一小時,。
   4. 洗滌同2。
   5. 加被檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,,，每孔200微升,。同時作稀釋液對照。37℃放置2小時,。
   6. 洗滌同2,。
   7. 加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小時。
   8. 洗滌同2,。
   9. 加底物：鄰苯二胺溶液加200ml,，室溫暗處10--15分鐘。
   10. 加終止液：每孔50微升,。
   11. 觀察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490nm讀數(shù),。