蘇州千舍生物-細(xì)胞培養(yǎng)知識之細(xì)胞液黑色運動顆粒物

在細(xì)胞培養(yǎng)中?？梢姷郊?xì)胞及培養(yǎng)液中有一些大小不等,、形態(tài)不同的黑色顆粒在運動,。如果鏡下檢查(100x)每視野計數(shù)在10個以上者就可能使細(xì)胞生長受到影響,，如果其數(shù)量再增多細(xì)胞可停止增殖繼而死亡,。人們常稱這種顆粒為黑膠蟲或中毒顆粒,。

一,、關(guān)于黑膠蟲的描述

1、分類上的描述：對于黑膠蟲的分類,，學(xué)術(shù)界沒有明確給予說法,。關(guān)于黑膠蟲的分類，目前大部分人認(rèn)為黑膠蟲污染是微生物感染,。在一些文章論述上把黑膠蟲歸為生物污染類型,，但是沒把它歸為確定的生物分類類型，只是把黑膠蟲獨立為一種未知生物,。而根據(jù)中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲,，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，但是由于課題經(jīng)費不夠而不能繼續(xù)下去,，終也沒有有力證明黑膠蟲是屬于原蟲,。也有一些學(xué)者不認(rèn)為所謂的黑膠蟲污染是一種生物污染，而認(rèn)為是細(xì)胞碎片類物質(zhì),，是在細(xì)胞培養(yǎng)時,，細(xì)胞衰亡破裂產(chǎn)生的,；也有在文獻中報道說是玻璃瓶中類似氧化硅的物質(zhì)，那個文獻很少人找得到,；還有報道黒膠蟲是一種納米級的細(xì)菌,。

2、形態(tài)上的描述：形態(tài)上類似與桿狀細(xì)菌,，但長度比細(xì)菌長,，直徑約在0.5~1微米，顯微鏡觀察為黑色,，膠蟲成熟后呈線狀,，而且形態(tài)是橢圓形。

運動形式：在400x倒置顯微鏡小,，有典型的布朗運動（不規(guī)則的原地小距離抖動）,，即很多細(xì)胞培養(yǎng)者看到的，像黑色的小蟲游來游去,?？梢源┩笧V膜，也可以通過空氣傳播,，低倍下為黑色點狀,，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。但是在物理學(xué)上來說,，顆粒足夠小,，在液體中也是做布朗運動的,，這不足以說明黑膠蟲的布朗運動就證明它是生物,。

3、生理上的描述：

3.1抗性

抗細(xì)菌和抗霉菌的藥物對黑膠蟲均無效,，可以保守的判定黑膠蟲不屬于細(xì)菌,。

3.2環(huán)境抗逆性

將培養(yǎng)器材150度烘烤8小時，可以消除,，而黑膠蟲高壓滅菌泡酸都不死,。可見黑膠蟲可以耐高溫高壓,，而且還有點嗜酸,，如果證實它是生物的話，那它很有可能是微生物,，一種古菌,。

3.3營養(yǎng)條件

“黑膠蟲”可寄生于動物細(xì)胞，也可以生存于培養(yǎng)基中,，依靠細(xì)胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生,，并隨細(xì)胞傳代而傳代,。可見“黑膠蟲”可能是一種異養(yǎng)生物,。

二,、對黑膠蟲的各種猜測

1.非生物類

1.1細(xì)胞碎片類

在細(xì)胞培養(yǎng)的時候， 由于細(xì)胞代謝,、物質(zhì)交換,、周邊環(huán)境變化，尤其是在從37度培養(yǎng)箱中拿出來觀察的過程中,，由于液體培養(yǎng)基的比熱較大,，液內(nèi)溫度高于外界溫度，造成冷熱交換,、小范圍內(nèi)形成液體流動加劇,，當(dāng)然這些小歲末就會被攪動起來形成似乎“游動”的感覺；隨著細(xì)胞培養(yǎng)的繼續(xù),，部分細(xì)胞開始衰亡,，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂，破裂之后的細(xì)胞內(nèi)容物泄露到培養(yǎng)液中,。尤其是溶酶體的破壞,，連續(xù)性地造成其他細(xì)胞和細(xì)胞器的損傷，如果換液不很勤,，又會出現(xiàn)進一步破壞和殘渣的出現(xiàn),；再者，“黑膠蟲”問題是很多細(xì)胞培養(yǎng)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的問題,，但到目前為止尚未找到其監(jiān)測和排除的試劑和手段,，這首先是由于所謂“黑膠蟲”病原體根本難以收集和捕捉，這也從另一個側(cè)面證明了“黑膠蟲”問題的難以確定性,；再說任何一種外來的微生物在培養(yǎng)基中都會有生命活動的反應(yīng)和表現(xiàn),，而不是簡單地運動那樣的外觀性表現(xiàn)。舉一個例子：如果“黑膠蟲”的運動狀況已經(jīng)到了用顯微鏡已經(jīng)可以觀察出的程度,，其營養(yǎng)代謝和能量需求也就可想而知,。這樣，培養(yǎng)液中的影響消耗,、酸堿含量程度等都要發(fā)生明顯變化,。比如說：迅速的、大含量的沉淀,，pH值的迅速下降,，細(xì)胞大量破碎死亡、引發(fā)其它類型微生物侵染等等。而這些狀況,，在所謂的“黑膠蟲”感染中,，是很難觀察到的。同時“黑膠蟲”的出現(xiàn)而影響細(xì)胞狀態(tài)似乎得不到有力的證據(jù),。倒是細(xì)胞狀態(tài)下降的時候,，“黑膠蟲”明顯增多了。很有可能是細(xì)胞狀態(tài)下降時,，細(xì)胞衰亡產(chǎn)生的細(xì)胞碎片,。所以黑膠蟲屬于細(xì)胞碎片是比較可能和合理的。

1.2玻璃培養(yǎng)瓶中的類似氧化硅的東西

網(wǎng)上有一篇文章說,，黑膠蟲其實不是一種生物,，是無機物，其本質(zhì)是玻璃培養(yǎng)瓶里的硅顆粒,?？捎绊懠?xì)胞生長，細(xì)胞狀態(tài)好時,，不明顯,。細(xì)胞狀態(tài)較差，數(shù)量少時才容易看到,，的辦法是用一次性培養(yǎng)瓶,，可消除黑膠蟲影響。

血清聚合物產(chǎn)物

Hyclone胎牛血清SH30084.03  ,、Hyclone胎牛血清SH30406.02  ,、Hyclone胎牛血清SH30406.05 、Hyclone胎牛血清SH30396.03  ,、Hyclone胎牛血清SH30070.03

特級胎牛血清 SH30070.03E ,、Hyclone胎牛血清 SH30370.03  、活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03  ,、活性炭/葡聚糖處理胎牛血清,，熱滅活 SH30068.03HI ,、馬血清SH30074.03  ,、烏拉圭胎牛血清 SV30087. 03 、Hyclone胎牛血清SH30071.03 ,、Hyclone胎牛血清SV30160.03,。

BOVOGEN胎牛血清 SFBS 、BOVOGEN新生牛血清 SNCS,。

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101 ,、PAA 優(yōu)等胎牛血清FBS A15-151。

BI優(yōu)等胎牛血清 04-001-1ACS ,、BI ES級別胎牛血清 04-002-1A ,、

BI 間充質(zhì)胎牛血清 04-400-1A ,。

Corning胎牛血清 35-076-CV。

PAN胎牛血清FBS P30-3302  ,、PAN胎牛血清FBS ST30-3302 ,、PAN ES級別胎牛血清 ST30-2602 、PAN胎牛血清Plus ST30-3302P ,。

NTC優(yōu)等胎牛血清 SFBE,。

Gemini優(yōu)等胎牛血清 900-108 、Gemini特級胎牛血清 100-500  ,、Gemini科研用人AB血清100-512 ,。

TCB胎牛血清 101ZC。

Sigma 特級胎牛血清F2442 ,、Sigma正常人AB血清 H4522 ,。

SBI 無外泌體血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒裝A31608-02、馬血清16050-122,。

雙抗15140-122,、SV30010  、胰酶 25200-056,、SH30042.01 ,、GIBCO 胰酶 25200-072。

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐藥株

HCT8/5-fu 人回腸直腸腺癌細(xì)胞五氟尿嘧啶耐藥株

LOVO/5-FU 人結(jié)腸癌細(xì)胞五氟尿嘧啶耐藥株

HCT116/L人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病細(xì)胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌細(xì)胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人結(jié)腸癌細(xì)胞阿霉素耐藥株

HNE1/DDP人鼻咽癌細(xì)胞順鉑耐藥株

SGC7901/5-fu人胃癌細(xì)胞五氟尿嘧啶耐藥株

A549/DDP人肺癌細(xì)胞順鉑耐藥株

MCF-7/DDP人乳腺癌細(xì)胞順鉑耐藥株

A549/ADR人肺癌細(xì)胞阿霉素耐藥株

SGC7901/DDP人胃癌細(xì)胞順鉑耐藥株

SKOV3/DDP人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥株

HELA/DDP人宮頸癌耐順鉑細(xì)胞株

NCI-H1650 人肺支氣管癌細(xì)胞

RT4 人膀胱移行細(xì)胞乳頭瘤 、SK-N-MC 人神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞

SK-N-SH 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 ,、SW982 人滑膜肉瘤細(xì)胞

T98G 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 ,、U251MG(KO) 人類星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞

U266 人骨髓瘤細(xì)胞 、VCAP 人前列腺癌細(xì)胞

hTERT-HPNE 人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞 ,、ES-2 人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞

NCI-H1650人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 、H460 人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞

HACAT 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞 ,、HCT116 人結(jié)腸癌細(xì)胞

HEK293 人胚腎細(xì)胞  ,、HEPG2 人肝癌細(xì)胞

HGC27 人胃癌細(xì)胞(未分化) 、HT-29 人結(jié)腸癌細(xì)胞

HUVEC 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 ,、KYSE150人食道癌細(xì)胞

L02(HL7702)人正常肝細(xì)胞   ,、LOVO 人結(jié)腸癌細(xì)胞

MCF-10A人正常乳腺上皮細(xì)胞 、MCF7人乳腺癌細(xì)胞

LX-2 人肝星狀細(xì)胞 ,、MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞

2,、生物類

2.1支原體

有人曾認(rèn)為黑膠蟲可能是支原體污染，因為相對比較quan 威的網(wǎng)站文章指出,，黑膠蟲可以通過濾膜,，可以在空氣中傳播。而恰巧口腔支原體為人體口腔中之正常菌叢，所以實驗室之操作人員的污染亦可能為支原體的污染源,。但有人為此做了實驗證明黑膠蟲不會是支原體,，原因如下：

a、光鏡下可見,，因為體積不對,，支原體在普通顯微鏡下不能看到。

b,、多種染色后可見,，甚至hoechst即能將它染色，一般來說支原體用普通染色法不易著色,，用姬姆薩染色很淺,，革蘭染色為陰性。所以,，黑膠蟲是一種支原體的可能性比較小,。

2.2真菌

有很多人發(fā)現(xiàn)類似黑膠蟲的，但后確定是真菌,，二性霉素B對其有效,。那說明黑膠蟲不存在只是細(xì)胞培養(yǎng)中的真菌感染，還是說明黑膠蟲污染屬于真菌類污染物,。如果黑膠蟲是一種真菌,，那么由此引起的污染是不會引起那么多人的關(guān)注，即使它很特殊,。但是這不能排除那些認(rèn)為“黑膠蟲”是真菌的細(xì)胞者,，看到的只是一般真菌感染。由于細(xì)胞被感染了,，要進行拯救處理,，不像理論上那么簡單，稍有不注意都是很容易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗,，所以黑膠蟲是一種真菌也是不太可能,。

2.3寄生類原蟲

黑膠蟲屬于寄生類的原蟲，而不是細(xì)菌,、支原體,，也不是什么補體、細(xì)胞碎片或蛋白沉淀,。有人在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到膠蟲有兩種不同形態(tài),，一種較大,，運動較慢,，泛紅光；另一種較小，運動較快,，紅中帶綠,，個小的圍著個大的分布，很可能是公的圍著雌的,。這種生物也并非離開細(xì)胞就不能存活,，也有人做過這樣的試驗，單純培養(yǎng)過污染膠蟲的血清4周,，直到滿視野都是黑煤渣般的膠蟲,。給人的感覺是膠蟲和細(xì)胞一樣有叢集性，如果膠蟲密度低則生長緩慢,，如果手懶,，拖了幾天沒換液，待膠蟲生長到一定濃度后便會飛速分生,，細(xì)胞受感染的程度也大,，這時除了培養(yǎng)基中可見外，細(xì)胞表面通常也象長滿了粉刺,，所以有人認(rèn)為細(xì)胞旁分泌的某些因子可以抑制膠蟲的生長,。據(jù)說，中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲,，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處,，然而由于課題經(jīng)費不夠而不能繼續(xù)進行下去，所以并沒有明確的證據(jù)證明此項猜測的正確性,。

三,、解析

從前面關(guān)于黒膠蟲的描述可以看出，人們遇到的黒膠蟲并不都是一樣的,，有像細(xì)菌的,、有像支原體的、有像原蟲的,、有像真菌的,，還有像細(xì)胞碎片的。在國內(nèi)各實驗室的器材條件參差不齊,，而且實驗人員的操作質(zhì)量也不盡相同,，同一種現(xiàn)象也可能有些許差異，當(dāng)用描述出來的現(xiàn)象的差異可能變大也可能變小,。所以很多人看到細(xì)胞被細(xì)菌污染了,，不好處理，而卻描述出來的現(xiàn)象和流傳的黑膠蟲類似,，就會把培養(yǎng)失敗的原因歸結(jié)到無法處理的黒膠蟲污染,，甚至可能說它發(fā)現(xiàn)的是真正的黑膠蟲,。這樣的事情多了，黑膠蟲就會人為的變種,，像什么的都有,。黑膠蟲是否存在，還有待于科學(xué)的發(fā)展,。但有一點可以肯定的,，大部分人發(fā)現(xiàn)的“黒膠蟲”并不是真正那個未知的黒膠蟲，而是常見的細(xì)菌,、真菌,、原蟲等微生物污染。

關(guān)于黑膠蟲quan 威的報道,。在《細(xì)胞生物學(xué)雜志》有一篇關(guān)于《對細(xì)胞培養(yǎng)中一種黑色運動顆粒性質(zhì)的研究》論文,，文中經(jīng)過多種實驗驗證后指出：“在組織培養(yǎng)中常觀察到一種大小不等、形態(tài)不同的黑色運動顆粒,，它對培養(yǎng)細(xì)胞的生長有不良影響,，有時甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并能在一定條件下隨培養(yǎng)時間的增長而增加其數(shù)量,。人們常稱這種顆粒為黑膠蟲或中毒顆粒,，我們?nèi)〖?xì)胞培養(yǎng)用的血清、培養(yǎng)基和其他材料中的黑色運動顆粒,，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡,、透射電鏡、掃描電鏡對其形態(tài)學(xué)進行系統(tǒng)觀察,；并用顯微攝影觀察其活動情況,；用紫外分光及電泳透析進行生化分析，結(jié)果均證明該顆粒為無膜式結(jié)構(gòu),，無蛋白質(zhì)成分,，中性環(huán)境下帶正電荷，能譜掃描電鏡分析為硅復(fù)合物,，我們稱之為硅小體(B),，證明其活動屬布朗運動。本文進一步用電感耦合等離子發(fā)射光譜分析了培養(yǎng)液及雙蒸水中可溶性的硅含量在不同質(zhì)量的容器及不同時間的變化,，證明了硅小體的增多主要來源于培養(yǎng)液對玻璃器皿的侵蝕,，部分來源于被培養(yǎng)的細(xì)胞。