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概要

嘔吐毒素也稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）,，是由串珠鐮刀菌,、輪狀鐮刀菌以及多育鐮刀菌等產(chǎn)生的真菌毒素，大多存在于糧谷,、飼料及其制品中,。中毒后影響消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為惡心,、嘔吐,、頭痛、頭暈,、腹痛,、腹瀉等癥狀。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：玉米,、大麥,、小麥及其制品中嘔吐毒素不得超過1mg/kg，豬,、犢牛,、泌乳期動(dòng)物配合飼料中嘔吐毒素不得超過1mg/kg，牛、家禽配合飼料中嘔吐毒素不得超過5mg/kg,。

原理

測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng),。微孔板上包被有抗抗體。加入嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品,、酶標(biāo)抗原和抗體后,，游離的嘔吐毒素與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，抗體或抗體結(jié)合物與固定在微孔板上的抗抗體再結(jié)合,，沒有結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品,、酶標(biāo)抗原及抗體被洗去，加入TMB底物顯藍(lán)色,，加入終止液后顏色由藍(lán)變黃,，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測(cè)，吸光值與樣品中嘔吐毒素含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出嘔吐毒素的含量,。

試劑盒的組成

包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔）

DON標(biāo)準(zhǔn)品：0ng/mL ,、10ng/mL,、

40ng/mL、100ng/mL,、250ng/mL 1 瓶 × 1.0mL

DON抗體： 1 瓶 × 10mL
DON酶標(biāo)抗原： 1 瓶 × 10mL
10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50mL
DON稀釋緩沖液A： 1 瓶 × 50mL
DON稀釋緩沖液B： 1 瓶 × 50mL
顯色底物TMB： 1 瓶 × 17mL
終止液： 1 瓶 × 7mL
試劑盒說(shuō)明書： 1份
質(zhì)檢報(bào)告： 1份

需要的儀器,、試劑

儀器

酶標(biāo)儀 450nm（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者）
微量移液器：20μL-200μL單道，100μL-1000μL單道, 50μL-300μL八道
多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床,、高速均質(zhì)器）
酶標(biāo)板振蕩器
渦旋混合器
離心機(jī)
50mL離心管
1.5mL離心管
定性濾紙
過濾漏斗
天平：感量0.01g

試劑

純水（蒸餾水、去離子水）

樣品處理

5.1谷物（玉米,、小麥,、大麥、大米,、大豆）：

稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中,，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘）,，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,。
將上層提取液用普通濾紙過濾，吸取100μL濾液置于1.5mL離心管中,，加入400μL DON稀釋緩沖液A,，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數(shù)：25

5.2飼料（高靈敏度）：

稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中,，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘,，或搖床上振蕩40分鐘），3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。
將上層提取液用普通濾紙過濾,，測(cè)pH值,，如果不在pH6-8范圍內(nèi)，請(qǐng)用酸或堿,，進(jìn)行調(diào)整,。
吸取100μL濾液置于1.5mL離心管中，加入400uL DON稀釋緩沖液B,，用渦旋混合器混勻,。

稀釋倍數(shù)：25

5.3飼料：

稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘,，或搖床上振蕩40分鐘）,，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。
將上層提取液用普通濾紙過濾,，測(cè)pH值,，如果不在pH6-8范圍內(nèi)，請(qǐng)用酸或堿,，進(jìn)行調(diào)整,。
吸取50μL濾液置于1.5mL離心管中，加入450uL DON稀釋緩沖液B,，用渦旋混合器混勻,。

稀釋倍數(shù)：50

5.4發(fā)酵液：

吸取40μL液體樣品置于1.5mL離心管中
加入960μL DON稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻,。

稀釋倍數(shù)：25

5.5尿液樣品：

取5mL待檢樣品于15mL離心管中,，3000r/min，離心10分鐘
吸取100μL離心后澄清樣品置于1.5mL離心管中
加入400μL DON稀釋緩沖液A,，用渦旋混合器混勻,。

稀釋倍數(shù)：5

6． 酶聯(lián)免疫分析程序

6.1測(cè)定之前注意事項(xiàng)

使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏,。
在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn),。
所有溫育過程應(yīng)避免陽(yáng)光直射,，并按要求用蓋板覆蓋住酶標(biāo)板。

6.2溶液的配制

提取液的配制:純水（或蒸餾水,、去離子水）,。
洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋10倍后使用。（例如：取10 mL 濃縮液+90 mL純水, 可以用于32孔的檢測(cè)）,。

6.3測(cè)定程序

將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架,，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存,。
吸取50μL 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中,，然后各加入50μL的DON酶標(biāo)抗原、50μL的DON抗體,，加蓋,，在室溫溫育30分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。
倒出孔中的液體,，每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液,，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩30秒（或者手工振蕩），重復(fù)操作四次,。洗完后用力在吸水紙上拍干,。
每孔加入150μL底物，室溫避光溫育10分鐘,。
每孔加入50μL 終止液,。
置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻,，在450nm處測(cè)定吸光度值（OD值）,，參比波長(zhǎng)630nm。（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出,、打印濃度值）,。

7. 結(jié)果判定

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以DI一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B<蘇b>0）再乘以*，即百分吸光度值,。

百分吸光度值（%）＝	B	×*
	B<蘇b>0

以嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為X軸,，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出,。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度,。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析,。

樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一定的比例用純水進(jìn)行稀釋,。

8. 注意事項(xiàng)

室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低,。
在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在光線下,。
混合要均勻,，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。
終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì),，避免接觸皮膚,。
不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使用不同批次的試劑盒,，這樣會(huì)引起測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確,。
試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍,。

9. 試劑盒的性能指標(biāo)

檢測(cè)限LOD: 谷物0.15ppm（mg/kg）,，飼料0.25ppm（mg/kg），發(fā)酵液0.15ppm（mg/kg）,尿液0.05ppm（mg/kg）,。（LOD：空白樣品測(cè)定值+2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差SD）
定量限LOQ: 谷物0.25ppm（mg/kg）,，飼料0.5ppm（mg/kg），發(fā)酵液0.25ppm（mg/kg）,尿液0.1ppm（mg/kg）,。
定量檢測(cè)范圍：谷物0.25-6.0ppm,，飼料0.5-12.0ppm，發(fā)酵液0.25-6.0ppm,尿液0.1-1.0ppm,。