簡介：

維生素B₁₂又叫鈷胺素,，是維一含金屬元素的維生素,。自然界中的維生素B₁₂都是微生物合成的,，高等動植物不能制造維生素B₁₂,。維生素B₁₂是維一的一種需要一種腸道分泌物（內(nèi)源因子）幫助才能被吸收的維生素,。有的人由于腸胃異常,，缺乏這種內(nèi)源因子，即使膳食中來源充足也會患惡性貧血,。植物性食物中基本上沒有維生素B₁₂,。它在腸道內(nèi)停留時間長，大約需要三小時（大多數(shù)水溶性維生素只需要幾秒鐘）才能被吸收,。維生素B₁₂的主要生理功能是參與制造骨髓紅細胞,，防止惡性貧血；防止大腦神經(jīng)受到破壞,。

原理：

CLOVER VB12試劑盒的測定是基于免疫學(xué)中抗原抗體特異性反應(yīng)的原理而建立的,。微孔板包被有VB₁₂抗原。加入VB₁₂抗體和VB₁₂標準品或樣品提取液,。標準品或樣品中提取的VB₁₂能與酶標板上的VB₁₂包被原競爭性地結(jié)合定量的抗體,，沒有結(jié)合的抗體、標準品或樣品中提取的VB₁₂在洗滌步驟中被除去,。再加入酶標二抗與微孔中的VB₁₂抗體反應(yīng),。洗滌除去沒有反應(yīng)的酶標二抗。加入底物溶液溫育,，酶標記物將無色的顯色劑轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物,，加入終止液后顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在450nm 處測量每孔的OD值。OD值與樣品中的維生素B₁₂含量成反比,。

奶粉前處理:

1)         稱取1.0g奶粉樣品于50mL離心管中,，加入9mL 50℃純凈水溶解，即位復(fù)原乳樣品,。

2)         取1mL復(fù)原乳樣品到1mL離心管中,，4℃ 3000r/min離心10分鐘。

3)         去除上層脂肪層,，轉(zhuǎn)移出100μL中層奶液至一潔凈的離心管中,，加入稀釋緩沖液500μL，渦旋混勻待檢（1 份上層液＋5份稀釋液）,。

4)         取50μL 進行分析,。

試劑盒操作：

1)         取所需量的微孔板條裝在酶標板框架上。

2)         分別吸取50μL標準品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中,，再各加入50μL的抗體,，加蓋，室溫（25℃）溫育30分鐘,。

3)         倒出孔中的液體,，每孔加入250μL稀釋好的洗滌液洗滌，重復(fù)操作四次,。

4)         每孔加入酶標二抗100μL,， 室溫（25℃）溫育30分鐘。

5)         重復(fù)步驟3,，反復(fù)洗滌四次,。

6)         每孔加入100μL顯色底物,，室溫避光溫育10分鐘,。

7)         每孔加入50μL終止液，混勻,。

置于酶標儀中,，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值）,，參比波長630nm,。（iELisa全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）

注意事項

1)         室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低,。

2)         在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況,，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作,。

3)         標準物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。

4)         混合要均勻,，洗板要徹低（包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻）,。

5)         終止液為強酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚,。

6)         不要使用過了有效期的試劑盒,，也不要使用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定誤差,。