會(huì)員.png)
7
當(dāng)前位置：北京中檢維康生物技術(shù)有限公司>>技術(shù)文章>>黃曲霉毒素親和柱操作步驟簡(jiǎn)介
黃曲霉毒素親和柱操作步驟簡(jiǎn)介
黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是食品中產(chǎn)泛存在的一種高致癌性真菌毒素,，是Asperilus flavus和Asperillus parasiticus的二次代謝產(chǎn)物，黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,，AFB1）后在體內(nèi)經(jīng)羥基化而形成的產(chǎn)物，主要存在于動(dòng)物的可食部分,，如乳,、肝、蛋類等,，其中以乳形態(tài)較為常見,。是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性較大的真菌毒素。它可通過(guò)多種途徑污染食品和飼料,，直接或間接進(jìn)入人類食物鏈,，威脅人類健康和生命安全，對(duì)人體及動(dòng)物內(nèi)臟器官尤其是肝臟損害嚴(yán)重，該毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物,，普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中,。鑒于黃曲霉毒素對(duì)人類的巨大危害性，我國(guó)對(duì)其在食品中的含量作了嚴(yán)格規(guī)定,，其中,，乳制品中黃曲霉毒素允許量為5ug/kg（即5ppb）。
黃曲霉毒素親和柱的功能基于抗原與抗體間可逆的特異性結(jié)合反應(yīng),，使其可從復(fù)雜樣品基質(zhì)中特異性地回收目標(biāo)化合物,。上樣后，柱中以共價(jià)鍵形式偶聯(lián)在凝膠上的抗體會(huì)與抗原（即目標(biāo)化合物）特異性結(jié)合,，雜質(zhì)不會(huì)被結(jié)合,，大部分隨樣品溶液流出小柱。通過(guò)淋洗的方式除去小柱內(nèi)剩余雜質(zhì)后,，使用純甲醇或其他洗脫液（根據(jù)對(duì)應(yīng)產(chǎn)品說(shuō)明書選擇）進(jìn)行洗脫即可得到潔凈的目標(biāo)化合物溶液,，可直接用于后續(xù)檢測(cè)。
黃曲霉毒素親和柱操作步驟簡(jiǎn)介：不同標(biāo)準(zhǔn)樣品的提取不太一樣,，以國(guó)標(biāo) GB/T5009.22-2016 方法固體樣品為例
1.提取樣品：粉碎,、稱重5g樣品；用甲醇/水（70/30V/V）混合物將樣品高速混勻3分鐘,。
2.過(guò)濾：將提取的樣品槽紋濾紙或普通濾紙過(guò)濾,。準(zhǔn)確移取 8.0mL 濾液并加入 42.0mL1%Tween-20 PBS 或1%TritionX-100PBS 稀釋，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾,，至濾液澄清,，量取 25mL濾液備用。
3.吸附,、淋洗：將免疫親和柱連接于 50.0mL 玻璃注射器下,。準(zhǔn)確將處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中， 調(diào)節(jié)下滴速度,控制樣液以 1mL / min~3mL / min 的速度穩(wěn)定下滴,。待樣液滴完后（注：不要用空氣吹出殘留的液體,，防止下一步出現(xiàn)堵柱子的現(xiàn)象） ,往注射器筒內(nèi)加入 2× 10mL 水,以 2mL / min~4mL /min 穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后,用真空泵抽干親和柱,。 準(zhǔn)確加入 1.0mL 色譜級(jí)甲醇洗脫,， 流速為 1mL/min~2mL/min（1 滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中,。并收集于HPLC進(jìn)樣小瓶中,。
4.測(cè)定：HPLC直接進(jìn)樣，在經(jīng)過(guò)柱分離后,，被UVD光化學(xué)衍衍生器衍生化,，被熒光檢測(cè)器記錄各種黃曲霉毒素的濃度。