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染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 是一種用于表觀遺傳學(xué)研究的技術(shù),，可以快速反映蛋白質(zhì)-DNA 相互作用。 想要獲得理想的結(jié)果,，選擇適合的抗體固然很關(guān)鍵,，ChIP 流程中所有步驟也很重要。 該技術(shù)利用了多種分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法,。

CHIP免疫沉淀實驗原理：

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起,，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后,，利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA的片段沉淀下來,。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定,，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀,，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),，DNA的純化，以及DNA的鑒定,。因為ChIP實驗涉及的步驟多,，結(jié)果的重復(fù)性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應(yīng)設(shè)計相應(yīng)的對照,，而且對結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗,。對于剛剛開始使用ChIP技術(shù)的研究人員來說，使用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)會達(dá)到事半功倍的效果,。

CHIP免疫沉淀實驗步驟

細(xì)胞固定

甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián),，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布,。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)是*可逆的,，便于在后續(xù)步驟中對DNA和蛋白質(zhì)進行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%,，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時,，具體時間根據(jù)實驗而定。值得注意的是,，交聯(lián)時間如果過長,，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果,，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失,。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不*,，產(chǎn)生假陰性,。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。

染色質(zhì)斷裂

交聯(lián)后的染色質(zhì)可被超聲波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測）,，以便暴露目標(biāo)蛋白,，利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質(zhì),，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫,，這都會引起蛋白質(zhì)變性,，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時,，要在冰上進行,，且要設(shè)計時斷時續(xù)的超聲程序，保證低溫,。另外,，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁,，以免產(chǎn)生泡沫,。總超聲時間也不要太長,，以免蛋白降解,。

通過五個步驟獲得理想 ChIP 結(jié)果

CHIP免疫沉淀建議

使用的交聯(lián)劑類型取決于需要觀察的相互作用的類型

交聯(lián)不充分，以及與甲醛過度交聯(lián),，會增加背景信號并導(dǎo)致 DNA 丟失

過度交聯(lián)會影響抗原的結(jié)合,，掩蓋表位，妨礙超聲處理

在顯微鏡下比較樣品前后變化,，檢查細(xì)胞裂解的效率

不同類型的細(xì)胞有不同嚴(yán)格程度的裂解要求

如果在裂解中使用超聲處理,，應(yīng)將染色質(zhì)置于在冰上并將脈沖限制在 30 秒以內(nèi)，以避免蛋白質(zhì)因過熱而變性,。