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雙熒光素酶檢測實驗步驟
閱讀：4577 發(fā)布時間：2020-11-3一、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
一,、實驗方法
1. 培養(yǎng)293T細胞,，待細胞長滿后調(diào)整細胞濃度為1×105cells/ml，接種于24孔培養(yǎng)板,，每孔500uL,，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,，觀察細胞80%粘連,。
2. 制備轉(zhuǎn)染復合物
A) 用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋3’UTR雙熒光素酶報告基因載體，輕輕混勻,；
B) 用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋RBP過表達載體,，輕輕混勻；
C) Lipofectamine 2000使用前,，輕輕混勻,，用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋2.5μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻,，室溫孵育5min,；
D) 將A、 B,、C的液體加在一起,，輕輕混勻，室溫孵育20min,，轉(zhuǎn)染復合物形成,。
3. 將24孔板中200μl 培養(yǎng)基，再分別加入300uL上述混合液,，每孔終體積為500uL,。質(zhì)粒濃度均為500ng/孔,，每組設置3個復孔。
5. 37 ℃,，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-6h后,，吸掉上清液，加入500uL的*培養(yǎng)基,，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后備用,。
二、雙熒光報告基因檢測
2.1 實驗材料
雙熒光檢測試劑盒(promega E1910)
脫色搖床(海門市其林貝爾TS200A),，低溫冷凍離心機 (Sigma 3K15),，發(fā)光檢測儀 (Molecular Devices SpectraMax®i3 )。
2.2 實驗方法
具體實驗步驟參見試劑盒說明書
裂解細胞 ：吸盡細胞培養(yǎng)液后,， PBS輕柔漂洗兩次,，參考下表加入適量的1×PLB裂解液(用去離子水將5×Passive Lysis Buffer母液稀釋成1×PLB，可在4℃保存1個月),，室溫搖床放置15min充分裂解后備用,。
注：細胞裂解后可以立即測定，也可以先凍存,，待以后再測定,。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進行測定,。
水浴溶解Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶液后,，加入到1劑量的Luciferase Assay Substrate凍干粉中，充分溶解后分裝成若干小管,，儲存在-20℃(≦1個月)或-70℃(≦1年),，使用前水浴解凍，上下顛倒兩次并恢復至室溫備用
按照每個樣本100uL用量,，取適量50×Stop & Glo®Reagent,，用Stop & Glo®Buffer稀釋成1×Stop & Glo®Reagent，現(xiàn)配現(xiàn)用,。
按儀器操作說明書開啟化學發(fā)光儀或具有檢測化學發(fā)光功能的多功能酶標儀,，將測定間隔設為2秒，測定時間設為10秒,。
每個樣品測定時,，取樣品20uL，加入100uL LARⅡ試劑,，用槍打勻后測定RLU1(relative light unit),。
加入100uL1×Stop & Glo®Reagent，用槍打勻后測定RLU2(relative light unit),。
2.3實驗結(jié)果分析