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細(xì)胞劃痕實驗原理及步驟及注意事項
閱讀：10090 發(fā)布時間：2020-9-18細(xì)胞劃痕實驗原理
細(xì)胞劃痕實驗(Wound Healing)是一種操作簡單,，經(jīng)濟(jì)實惠的研究細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法。這種方法的原理是,，當(dāng)細(xì)胞長到融合成單層狀態(tài)時,，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”,，劃痕邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合,，在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程,，是研究細(xì)胞遷移的體外實驗中簡單的方法。細(xì)胞劃痕實驗是一種簡單易行的檢測細(xì)胞運(yùn)動的方法,，實驗成本低,，可以用來檢測貼壁生長腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
實驗材料：細(xì)胞樣品
儀器,、耗材：6孔板 marker筆 直尺 *頭 20微升槍頭(滅菌)
試劑,、試劑盒：無血清培養(yǎng)基、PBS
實驗步驟：
一.準(zhǔn)備：
所有能滅菌的器械都要滅菌,，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min（超凈臺內(nèi)）
二.流程：
(1)準(zhǔn)備工作：所有能滅菌的器械都要滅菌,，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min(超凈臺內(nèi))
(2)先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著,，均勻地劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道,，橫穿過孔,。每孔至少穿過5條線。
(3)在空中加入約5X105個細(xì)胞,，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同,，掌握為過夜能鋪滿。
(4)第二天用槍頭比著直尺,，盡量垂直于背后的橫線劃痕,，槍頭要垂直，不要傾斜,。
(5)用PBS洗細(xì)胞3次,，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基,。
(6)放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),。按0、6,、12,、24小時取樣，拍照,。
注意的幾個問題：
1,、劃痕前是不倒培養(yǎng)基的，劃痕后再倒掉培養(yǎng)基加PBS清洗后加吳學(xué)謙培養(yǎng)基,；
細(xì)胞長到融合成單層狀態(tài)時,，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”,。劃痕邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合,。因此是整個培養(yǎng)皿都加培養(yǎng)基的，觀察部位是劃痕而已。
2,、通過算每個視野的劃痕面積,，可以通過image J 軟件計算。
3,、劃痕法的意義在于,，價格低廉，操作簡單,。還有很重要的一點(diǎn)在于細(xì)胞外圍環(huán)境簡單單純,，容易控制。（比如做加藥的,，可能會和血清的組分有反映,，而且受血清批次的影響，造成誤差,。如果是鋪了ECM物質(zhì)的,，組分就更復(fù)雜了。）
.劃痕法測量適用的細(xì)胞范圍較小,，一般只適用于上皮細(xì)胞,，纖維樣細(xì)胞。因為
a.這些細(xì)胞本身有遷移能力,，且較強(qiáng),。
b.細(xì)胞有極性，方便測量,，觀察,。
c.細(xì)胞對無血清有較強(qiáng)的忍受力（至少24小時），因此很多腫瘤細(xì)胞系是不適合做劃痕的,，很多腫瘤細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)下,，12小時細(xì)胞凋亡就超過50%。這也就是transwell發(fā)展的大要求,。而一些上皮樣細(xì)胞系甚至可以忍受高達(dá)72小時的無血清實驗,。足以彌合劃痕。
4,、其實在傷口彌合中,，fibroblast的向創(chuàng)口處遷移就是典型的側(cè)向爬行。但是其實癌細(xì)胞的遷移倒不是側(cè)向爬行那么簡單,，我覺得應(yīng)該是綜合效應(yīng),，而且要看是什么類型的腫瘤。因為對于遠(yuǎn)端病灶的轉(zhuǎn)移,，顯然是通過血液運(yùn)輸?shù)?。這是一個細(xì)胞去黏附和再黏附的過程,。其實transwell也不能很好的模仿這個過程。只是transwell+matrigel可以模仿腫瘤細(xì)胞融解基質(zhì),，侵入到正常組織的這個過程,。也就是侵襲。所以對于做cancer的來說,，可能transwell會更好些,。但我覺得并不能就簡單否定scar assay。細(xì)胞的遷移作為細(xì)胞的一個正常生理活動,，是表征細(xì)胞生理變化的一個重要指標(biāo),。這點(diǎn)是很主要的意義。