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Western blotting檢測組織中蛋白表達實驗報告書
閱讀：4524 發(fā)布時間：2019-12-9一,、 實驗儀器與試劑
表格一：實驗儀器
儀器 | 廠家 | 型號 |
小型垂直電泳槽 | Biorad | 164-8001 |
轉(zhuǎn)印槽 | Biorad | Trans-Blot |
脫色搖床 | 常州澳華 | TY-80B |
電泳儀 | 上海天能 | EPS-200 |
低溫高速離心機 | 64R | BECKMAN |
酶標儀 | Thermo Scientific | Multiskan Spectrum |
表格二：試劑
試劑 | 廠家 |
RIPA 裂解液 | 碧云天 |
PMSF | Amresco |
BCA 蛋白定量試劑盒 | Thermo |
Tris | Amresco |
甘氨酸 | Amresco |
鹽酸 | 國藥集團 |
甲醇 | 國藥集團 |
Tween 20 | 國藥集團 |
SDS | 國藥集團 |
TEMED | Sigma |
BSA | Sigma |
PVDF 膜 | Millipore |
HRP 標記的羊抗小鼠二抗 | 聯(lián)科生物 |
化學發(fā)光檢測試劑 | Thermo |
GAPDH 鼠單克隆抗體 | 聯(lián)科生物 |
預染蛋白 marker | 碧云天 |
X 光膠片 | 柯達 |
二,、 實驗步驟
1,、組織中蛋白上清液的制備和濃度測定
把組織剪切成細小的碎片,；
加入 200μL 裂解液，在勻漿機中研磨,，直至裂解液中組織消失,；
充分裂解后，12000rpm 離心 5min,，取上清,。
取部分上清蛋白用 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,，按如下步驟： ①按試劑盒說明書將 A 液和 B 液以 50：1 的比例配制成工作液；
②取 2000μg/mL 的 BSA 標準品,，用 PBS(pH 7.4)稀釋成 2000μg/mL,、1500μg /mL、1000μg/mL,、
750μg/mL,、500μg/mL、250μg/mL,、125μg/mL,、25μg/mL、0μg/mL 共 9 個濃度梯度,；
③取上清液 10μL,，用 PBS 稀釋 20 倍；
④每管中加 20μL 蛋白標準品或稀釋后的上清液,，再加上述工作液 0.2mL,，37℃孵育 30min，
562nm 處測吸光度,，記錄 OD 值,；
⑤根據(jù)蛋白標準品的濃度及相應 OD 值繪制標準曲線：
根據(jù)標準方程計算樣品總蛋白濃度（mg/mL）
樣品 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
OD 值 | 0.817611 | 0.438412 | 0.657716 | 0.675617 | 0.362568 | 0.817774 | 0.688089 | 0.477546 | 0.627511 |
0.991314 | 0.517018 | 0.814846 | 0.748083 | 0.460470 | 0.622999 | 0.574448 | 0.404516 | 0.700393 | |
均值 | 0.904462 | 0.477715 | 0.736281 | 0.711850 | 0.411519 | 0.720386 | 0.631268 | 0.441031 | 0.663952 |
濃度 |
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mg/mL | 21.46 | 9.27 | 16.66 | 15.96 | 7.38 | 16.21 | 13.66 | 8.22 | 14.59 |
2、Western-Blot 檢測總蛋白中目的蛋白表達,。
灌膠
①蒸餾水清洗灌膠玻璃板,，豎直晾干。
②配制 13％分離膠 10mL,，加 TEMED10μL,、10％過硫酸銨 100μL，混勻后立即灌膠,，灌至齒梳下緣 2～3mm（事先做好標記）,，用異丙醇封閉液面以去除氣泡并隔絕空氣，室溫靜置 45min 待膠*聚合,。
③待分離膠*聚合后,，傾去其頂部的去離子水，用濾紙將水吸干,。
④配制 4％濃縮膠 5 mL,，加 TEMED 5 μL、10％APS 50 μL,，混勻立即灌膠,，灌至頂部，并垂直插入 Teflon 齒梳,，室溫靜置 20 min 待膠聚合,。
⑤待膠*聚合后拔出梳子,，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液,，用電泳緩沖液沖洗上樣孔以去除氣泡,。
電泳
①取各個處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度為 6μg/μL,，和等體積 2×上樣緩沖液混合,，即為上樣液。
②將上樣液于 100℃沸水中煮沸 5min,，使蛋白變性,，冰上驟冷，3000 轉(zhuǎn)/min 離心 1min,。
③每孔加上樣液 15μL,，留一孔加 10μL 預染的 Marker。加滿電泳緩沖液,，蓋上槽蓋，接通電源,，先用 80v 恒壓電泳,，約 20min，當指示劑溴酚藍進入分離膠后改用 110v 恒壓電泳,，當指示劑到達距凝膠下端約 0.5cm 處時關(guān)閉電源,，取出膠板。
轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測
①在電泳即將結(jié)束前,，預先將 PVDF 膜浸泡在甲醇中 15s,，然后用 ddH2O 漂洗 2min，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中 5min 后開始后續(xù)操作,。
②在水中撬膠,，修膠后將膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 15min。
③按黑面（負極）→海綿→濾紙→膠→PVDF 膜→濾紙→海綿→紅面（正極）的順序制備轉(zhuǎn)膜“三明治”,，每層鋪好后先趕走氣泡再鋪另一層,。在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可避免氣泡的產(chǎn)生。
④接上正負極,，按膜向正極的方向?qū)⑥D(zhuǎn)移盒放入電轉(zhuǎn)儀中,，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液。
⑤將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中,，100V 恒壓轉(zhuǎn)膜 1h,。
⑥轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，快速取出 PVDF 膜,，放入 5%BSA 室溫封閉 2h,。
⑦取出膜,，于搖床上用 TBST 洗膜 5min×3 次。
⑧孵育袋中加入 TBST 稀釋的一抗（1：500）4℃孵育過夜,。
⑨TBST 洗膜 5min×3 次,，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠二抗（1：3000），室溫孵育 1h,。
⑩TBST 洗膜 10min×3 次,。膜于化學發(fā)光檢測試劑反應至暗處出現(xiàn)亮條帶，取出膜,，甩去多余的液體,，用保鮮膜包好 PVDF 膜，暗室中用 X 膠片感光,、顯影,、定影。
