Q1. 細(xì)胞如何貼壁或者固定好？

這是第一步,，也是基礎(chǔ)和關(guān)鍵的一步,，這是基礎(chǔ)，基礎(chǔ)不好,，后面一切都是白搭,。

對(duì)于貼壁細(xì)胞: 先將潔凈的爬片片在 70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理，然后用干凈無(wú)菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中,，用無(wú)菌 PBS 洗去殘留的乙醇,。待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片(一般都是過(guò)夜培養(yǎng))操作小心，防止細(xì)胞脫片,。

對(duì)于懸浮細(xì)胞: 如果能像貼壁細(xì)胞一樣,，那就好了。傳統(tǒng)這是一個(gè)痛點(diǎn)待解決,，其實(shí)新的方法就是使用靶點(diǎn)科技（Biotarget）的懸浮細(xì)胞免疫熒光專用玻片,。讓懸浮細(xì)胞簡(jiǎn)單四步，就能像貼壁細(xì)胞一樣固定好,，主要是,，細(xì)胞還是活的，還可以刺激,。

Q2. 如何避免多種染色互串？

*細(xì)胞不能鋪的太密，細(xì)胞稀釋一下,，濃度不能太高,，盡可能用大體積來(lái)鋪細(xì)胞。太密就導(dǎo)致一抗結(jié)合蛋白增多,，更容易出現(xiàn)非特異性染色,，且細(xì)胞太密，顯微鏡拍照出來(lái)的效果就會(huì)很一般,，一般6孔板滿孔的貼壁細(xì)胞,，取1/8的量鋪到帶有爬片的12孔板里，大概12小時(shí)后,，細(xì)胞密度就剛剛好,。懸浮細(xì)胞，直接用靶點(diǎn)科技的懸浮細(xì)胞免疫熒光專用玻片就行,。雙抗體染色時(shí)可不用活細(xì)胞染核液（Hoechst）,，也就是不要最開(kāi)始染核，放到最后封片時(shí),，用DAPI染,，DAPI濃度不要過(guò)高，核很容易被染色,，低濃度染色即可,。

*支原體清除后再做IF。用狀態(tài)好,，未被污染的細(xì)胞去做IF,，狀態(tài)好的細(xì)胞伸展很開(kāi)，染色效果也更好,，若細(xì)胞支原體污染,，可能會(huì)產(chǎn)生背景臟，圖像不完整等現(xiàn)象,，非特異性染色嚴(yán)重且去不掉,，染核染抗體都會(huì)被染上亂七八糟的東西。

*一抗?jié)舛鹊膯?wèn)題,。雙抗體染色若外轉(zhuǎn)質(zhì)粒,，可染標(biāo)簽抗體，標(biāo)簽抗體更特異且使用濃度低,，一般都在1：500左右,；若染內(nèi)源性蛋白，濃度可1：200,，做之前記得看下抗體說(shuō)明書該抗體是否可以做IF,；4度過(guò)夜染效果更好,，一抗可回收,，負(fù)20保存,，大概可用3次，根據(jù)抗體靈敏度決定使用次數(shù),；雙抗體IF,，一定要用不同來(lái)源的的抗體，一個(gè)用鼠,，一個(gè)用兔,，最好不要雙鼠或者雙兔的。

*二抗：常溫孵育1～2h,，避光,，避開(kāi)同屬性的二抗，洗滌一抗可用pbs,，洗滌二抗可以用tbst,，多加一些吐溫。吐溫可以洗滌掉非特異結(jié)合的抗體,，多洗幾次,。

*拍攝：封片后拍攝時(shí)，可以適當(dāng)縮短激發(fā)光波長(zhǎng),，使其沒(méi)有交叉波長(zhǎng),。比較好的選擇：綠光488，紅光555,。重合的波譜,，就會(huì)不單純激發(fā)。拍出來(lái)就不單純,。