脾臟處理

1.將兩個已解剖分離的脾臟，置于一個15 mL離心管頂部配備的70 μm細胞篩網(wǎng)上,。使用無菌注射器的柱塞，以溫和力度將脾組織壓碎以通過細胞篩網(wǎng)進行勻漿處理,，確保不破壞細胞結構,。在整個過程中，分次使用總計6 -10mL的含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基,，逐步?jīng)_洗篩網(wǎng)以收集細胞,。2.將收集到的細胞懸液以500 × g離心5分鐘，隨后,，小心地去除上清液,，并將細胞沉淀重懸于5 mL的紅細胞裂解緩沖液中，在室溫下靜置孵育5分鐘,。孵育結束后,，迅速加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS）以終止紅裂過程，再次以500 × g離心5分鐘,。若沉淀中仍有殘留紅細胞,，需重復上述裂解和洗滌步驟，直至肉眼所見無紅色,。3.細胞計數(shù)與活力檢測：完成裂解后,，以500 × g離心5分鐘，丟棄上清液,，然后將細胞沉淀用1 mL PBS重新懸浮,。接下來，采用臺盼藍排除法鑒別活細胞,，在血細胞計數(shù)板上進行精確的細胞計數(shù),，以確定活細胞的數(shù)量,。這種方法基于臺盼藍無法穿透活細胞膜而能夠染色死細胞的原理，從而區(qū)分出活細胞和死細胞的比例及總數(shù),。4. 通過流式檢測抗體標記的脾臟細胞,。尤其需要注意一點，對于脾臟巨噬細胞的流式檢測,，在抗體標記前,，需要Fc受體的封閉，避免非特異染色,。5. 大家拿到自己的流式結果后,，如果實驗結果不符合自己的預期。這時最需要做的就是質(zhì)控自己的流式數(shù)據(jù),，比如細胞的分群,，大概比例，細胞的死活,，細胞的數(shù)量,，分群是不是集中，一定要找文獻,，無論如何,，對照組的正常小鼠，這個數(shù)據(jù)是可以參考的,。如果自己的流式數(shù)據(jù)對著文獻都不太符合常規(guī),，就不要給給實驗下結論。這時,，基礎的實驗體系就有問題,。

6. 對于巨噬細胞，CD11b和F4/80雙標,，肝臟和脾臟,，還有腹腔，肯定會有三群（根據(jù)這兩個maker的表達高低）,。對于很多用荷蘭liposoma品牌的巨噬細胞清除劑clodronateliposomes氯膦酸二鈉脂質(zhì)體的客戶來說,，清除組和對照組，也可以參考這個圖,。