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懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)節(jié)及免疫熒光IF經(jīng)驗(yàn)分享

時(shí)間:2023-6-4閱讀:2075

細(xì)胞培養(yǎng)類型可以分為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞兩種,,只有極少數(shù)類型細(xì)胞同時(shí)存在兩種狀態(tài)。

懸浮細(xì)胞是指不需要依賴支持物,,可在培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)生長的一類細(xì)胞,,如淋巴細(xì)胞和大部分血液系統(tǒng)來源細(xì)胞。(如小鼠白血病細(xì)胞WEHI-3, 人白血病細(xì)胞K-562, HL-60)。工業(yè)上也有越來越多的貼壁傳代細(xì)胞被馴化出來,進(jìn)行全懸浮的培養(yǎng),。目前在工業(yè)中應(yīng)用的主要有SP2/0,、NS0,、CHO,、BHK和HEK293細(xì)胞等,,它們主要用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn),;在獸用生物制品中常用的傳代細(xì)胞主要有采用全懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞,、MDCK細(xì)胞,;及借助微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞,、PK細(xì)胞,、ST細(xì)胞,、 Marc145細(xì)胞等,,每種細(xì)胞的特性都不同,。

一般情況下,,懸浮細(xì)胞相較于貼壁細(xì)胞的處理更加簡單一些,因?yàn)閼腋〖?xì)胞傳代時(shí)無須胰酶消化,。但這并不意味著懸浮細(xì)胞比貼壁細(xì)胞好養(yǎng),,對新手來說,反而更具挑戰(zhàn)性,??偸菚龅礁鞣N各樣的問題:比如,為什么總是出現(xiàn)死細(xì)胞和細(xì)胞分化;說好了傳代很easy的,,結(jié)果會出現(xiàn)分化,;養(yǎng)好了凍存復(fù)蘇后又出現(xiàn)問題了!


養(yǎng)好懸浮細(xì)胞,,有如下大眾經(jīng)驗(yàn)分享,。


要點(diǎn)一:足夠的耐心,這是非常必要的

很多懸浮細(xì)胞在剛從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時(shí)活力是相對較差的,,此時(shí)我們需要有足夠的耐心,,等待細(xì)胞完成自我修復(fù)進(jìn)入對數(shù)增長期。比如THP-1(人單核細(xì)胞白血?。慕鈨龅交謴?fù)正常增殖往往需要7-10天的恢復(fù)期,;Jurkat,Clone E6-1(人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞)復(fù)蘇后也需要5-7天才能恢復(fù)到凍存前的狀態(tài),。新手可能會在此期間放棄培養(yǎng),,所以,請多一點(diǎn)耐心哦,!培養(yǎng)這類細(xì)胞也是培養(yǎng)耐心的過程呢,!

要點(diǎn)二:接種密度的把握

一般來說,懸浮細(xì)胞接種時(shí)密度不應(yīng)低于50萬個(gè)/ML,,很多懸浮細(xì)胞有密度依賴,,密度低導(dǎo)致的不增殖也是新手常見問題之一。當(dāng)然,,有極少數(shù)細(xì)胞在密度高時(shí)反而狀態(tài)變差,,如W6/32(小鼠B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞)。因此,,培養(yǎng)不了解的細(xì)胞前查找相關(guān)資料去掌握細(xì)胞特性非常重要,。


要點(diǎn)三:換液方法及頻率

換液頻率不應(yīng)該被限制得“明明白白",細(xì)胞是活物,,在一個(gè)連續(xù)培養(yǎng)周期內(nèi),,視細(xì)胞生長狀態(tài)可分多次添加補(bǔ)充培養(yǎng)基、葡萄糖等特定營養(yǎng)成份,,維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài),。懸浮培養(yǎng)過程中,隨著細(xì)胞的增殖,,原有培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,,代謝產(chǎn)物的增加,細(xì)胞的活率會下降,,及時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì),,使細(xì)胞處于一個(gè)相對良好的生存環(huán)境,。切忌頻繁離心換液。參考換液方法:

①離心全換液法

即通過離心(800-1000rpm,,5min)去除全部舊的培養(yǎng)基,,更換新鮮培養(yǎng)基。該方法適合“皮實(shí)“好養(yǎng)的懸浮細(xì)胞換液(如K562),,或者當(dāng)前細(xì)胞狀態(tài)良好,、密度較高導(dǎo)致培養(yǎng)基消耗較大的情況。此方法的優(yōu)點(diǎn)是換液到位,,能去除部分細(xì)胞碎片,,但是同樣會對細(xì)胞造成一定程度的機(jī)械損傷。

②離心半換液法

即通過離心(800-1000rpm,,5min)50%細(xì)胞懸液,,更換50%體積的新鮮培養(yǎng)基。該方法適合比較“矯情“難養(yǎng)的細(xì)胞(如thp-1),,或者正在調(diào)整狀態(tài)中,、密度較低但碎片較多需要去除的情況。

③沉降換液法

即不使用離心機(jī)而是利用重力自然沉降的方法,,將培養(yǎng)基與細(xì)胞分離,,達(dá)到全部或部分更換新鮮培養(yǎng)基。但是其有應(yīng)用局限性—只適合能成一定大小細(xì)胞團(tuán)(否則無法自然沉降,,只能低速離心)的細(xì)胞,,尤其是處理依賴細(xì)胞聚集才能增殖的細(xì)胞時(shí)非常值得推薦,如NK-92,、NK-92 MI,、Jurkat。該方法能在換液過程中最大限度避免離心過程造成的機(jī)械損傷,,同時(shí)保留聚集的細(xì)胞團(tuán),,并且去除細(xì)胞碎片也較為干凈,。


固定懸浮細(xì)胞,,有如下私房經(jīng)驗(yàn)分享。


養(yǎng)好懸浮細(xì)胞,,需要用化合物等試劑刺激懸浮細(xì)胞,,或者共培養(yǎng)。使用免疫熒光來檢查懸浮細(xì)胞,,一直給很多新手,,甚至高手造成心理陰影。如何固定好懸浮細(xì)胞,?如何確保不掉片,?甚至如何讓懸浮細(xì)胞貼壁來做實(shí)驗(yàn),?是很多實(shí)驗(yàn)者的奢望。懸浮細(xì)胞固定/免疫熒光專用玻片給帶來解決方案,。


如下是一些懸浮細(xì)胞固定后做的免疫熒光圖片,,可以參考。



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