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BiometraPCR儀 - 技術原理,；
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝,。在聚合酶鏈式反應實驗中發(fā)現,，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈,。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。
 
但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不僅操作煩瑣,，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展,。發(fā)現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術變得非常簡捷,、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用,，并逐步應用于臨床,。
 
1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標記,，下游引物不標記。在模板擴增的同時,，內標也被擴增,。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同,，二者的擴增產物可用電泳或高 效液相分離開來,，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板,。
 
2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板,。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）,。擴增后用內切酶消化PCR產物,，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高 效液相將兩種產物分開,，分別測定熒光強度,，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
 
3）PCR－ELISA法：利用或生物素等標記引物,，擴增產物被固相板上特異的探針所結合,，再加入抗或生物素酶標抗體－辣根酶結合物，終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗,，若加入內標，作出標準曲線,，也可實現定量檢測目的,。
 
2．內標在傳統(tǒng)定量中的作用
 
由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測,，即PCR到達平臺期后進行檢測,，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差,。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗,，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量,。加入內標后,，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此,，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量,、粗略定量的方法。
 
建立樣品準備區(qū)
 
這個區(qū)域專門用作樣品的準備,，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：⑴PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作,。⑵組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理,，以根據應用的需要提取DNA或RNA,。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列,。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作,，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取,。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生,，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠,。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套,，手套要經常更換,，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間,，經常清洗,。
 
2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作,，這樣增加了樣品之間污染的機會,。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區(qū)進行,。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道,。
 
3、建立前PCR區(qū),。
 
該去專門用于準備各種反應,，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染,。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備,，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。