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Bio-Rad-pcr儀反應體系與反應條件標準的PCR反應體系：
①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右,。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補,，特別是3’端的互補,，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶,。
⑤引物3’端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列好有適宜的酶切位點,，這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
Bio-Rad-pcr儀 - 工作原理,；
類似于DNA的天然復制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時 聚合酶鏈式反應間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應作準備,；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈",，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。
每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。
Bio-Rad-熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料,。
現(xiàn)將其原理簡述如下：
熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成,，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。