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分光光度計(jì)是一種在科學(xué)研究中經(jīng)常會(huì)用到的儀器。它用來(lái)定量測(cè)量分光光度計(jì)中穿過(guò)樣品的光線(xiàn)有多少被化學(xué)物質(zhì)吸收,。
分光光度計(jì)是一種在生物,,化學(xué),臨床和環(huán)境研究中普遍使用的儀器,。
分光光度法是通過(guò)在分光光度計(jì)中使光束通過(guò)樣品來(lái)測(cè)量化學(xué)品可以吸收多少光,。
通過(guò)測(cè)量檢測(cè)到的光強(qiáng)度,該方法可用于確定樣品中溶質(zhì)的濃度,。
分光光度法的概念
發(fā)送到樣品的光束由光子束構(gòu)成,。
當(dāng)光子遇到樣品中的分子時(shí),分子可以吸收其中的一些分子,,減少光束中的光子數(shù)量并降低檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度,。
透射率是穿過(guò)樣品的光的一部分。它被定義為在入射光強(qiáng)度下穿過(guò)樣品的光強(qiáng)度,。
吸光度與透射率相反,,對(duì)應(yīng)于分光光度計(jì)測(cè)量的量。
根據(jù)吸光度,,溶液樣品中的濃度可以從比爾 - 朗伯定律確定,,其表明吸光度和樣品濃度之間存在線(xiàn)性關(guān)系。根據(jù)Beer-Lambert定律,,吸光度是吸收系數(shù)的乘積,,吸收系數(shù)是給定波長(zhǎng)下溶質(zhì)吸收的光量的量度,是光通過(guò)的距離。樣品,,或行進(jìn)距離,,以及溶質(zhì)的濃度。通常,,測(cè)量吸光度的目標(biāo)是測(cè)量樣品的濃度,。
分光光度計(jì)的組件
每個(gè)分光光度計(jì)包含一個(gè)光源,一個(gè)準(zhǔn)直器(透鏡或一個(gè)傳輸強(qiáng)烈和直線(xiàn)光束的聚焦裝置),,一個(gè)單色器,用于分離不同波長(zhǎng)的光束,,以及一個(gè)長(zhǎng)度選擇器 用于選擇所需波長(zhǎng)的波或槽,。 在該視頻中呈現(xiàn)的分光光度計(jì)中使用的光的波長(zhǎng)在紫外和可見(jiàn)光的范圍內(nèi)。 分光光度計(jì)還包含樣品架,,光電探測(cè)器和顯示探測(cè)器結(jié)果的屏幕,。
最近的分光光度計(jì)直接耦合到計(jì)算機(jī),其中可以控制實(shí)驗(yàn)參數(shù)并顯示結(jié)果,。
分光光度計(jì)的工作原理
進(jìn)行分光光度測(cè)定時(shí),,請(qǐng)務(wù)必采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施,例如戴手套,,具體取決于您使用的生物或化學(xué)溶液的類(lèi)型,。
在測(cè)量樣品的紫外-可見(jiàn)光譜之前,打開(kāi)設(shè)備并讓燈和電子元件加熱,。
準(zhǔn)備相同溶液的空白樣品,,具有相同的pH和相似的離子強(qiáng)度,但沒(méi)有分析的組分;由于比色皿和溶劑可以分散光,,因此分析該樣品是必要的步驟,。
傳統(tǒng)的分光光度計(jì)樣品架設(shè)計(jì)用于容納塑料和石英碗。將原始溶液吸移到碗中,。
擦去任何指紋并濺到碗的外側(cè)后,,將比色杯正確插入樣品架并關(guān)閉杯蓋門(mén)。
永遠(yuǎn)不要忘記關(guān)上門(mén),,因?yàn)閺拈_(kāi)放式分光光度計(jì)發(fā)出的紫外線(xiàn)輻射會(huì)損壞眼睛和皮膚,。
編程將傳輸?shù)綐悠返乃璨ㄩL(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍。這取決于分析的組分可以吸收的最佳波長(zhǎng),。然后,,通過(guò)測(cè)量空白樣品使機(jī)器歸零,這將減去由于樣品緩沖液引起的底部吸光度,。
根據(jù)您正在進(jìn)行的分光光度實(shí)驗(yàn)的類(lèi)型,,可能需要在樣品測(cè)量之前生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),從中可以最終確定樣品中分析的化合物濃度。
讓樣品達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟炔⑤p輕混合,,以免引入氣泡,。然后可以將樣品直接添加到機(jī)器內(nèi)部的碗中,并且可以進(jìn)行讀數(shù),。
對(duì)樣品進(jìn)行吸光度測(cè)量后,,對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠?jì)算;例如,確定濃度或酶活性水平,。
分光光度計(jì)的應(yīng)用
分光光度計(jì)的通常用途之一是測(cè)量細(xì)胞密度,。細(xì)胞密度測(cè)量可用于產(chǎn)生細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線(xiàn),從中可以確定重組蛋白整合的最佳時(shí)間,。
分光光度計(jì)還可用于測(cè)量化學(xué)反應(yīng)速率,。在該實(shí)施例中,吸光度用于監(jiān)測(cè)酶促反應(yīng),,通過(guò)452nm的中間反應(yīng)隨時(shí)間消失,。可以通過(guò)將數(shù)據(jù)與適當(dāng)?shù)牡仁狡ヅ鋪?lái)計(jì)算該酶促步驟的速率,。
微量分光光度計(jì)的引入消除了對(duì)樣品架的需求,。這些分光光度計(jì)使用表面張力來(lái)保持樣品。
微量分光光度計(jì)是測(cè)量昂貴的小體積樣品(如生物分子,,包括蛋白質(zhì)和核酸)的質(zhì)量和濃度的*,。
蛋白質(zhì)在280nm處的吸光度取決于在色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸中發(fā)現(xiàn)的芳族側(cè)鏈的含量,,以及兩個(gè)半胱氨酸之間存在的二硫鍵,。
蛋白質(zhì)的濃度可以由其在280nm處的吸光度和其吸收系數(shù)確定,該吸收系數(shù)基于氨基酸的組成,。
DNA和RNA在260nm處具有最大吸光度,,從中可以確定它們的濃度。還可以從吸光度讀數(shù)與特定波長(zhǎng)的比率來(lái)評(píng)估核酸的純度,。