大家都知道,，細(xì)胞是由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成,，這對大分子物質(zhì)來說是個不可透過的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架,，為了使核酸穿過細(xì)胞膜,，開發(fā)了多種技術(shù)，大致可分為物理介導(dǎo),、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo),。

幾種常見的轉(zhuǎn)染方法：

1、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,，能與核酸的磷酸根通過靜電作用,，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物,，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附,，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實(shí)驗(yàn)室***的轉(zhuǎn)染方法之一,，其轉(zhuǎn)染率較高,，優(yōu)于磷酸鈣法。

2,、磷酸鈣共沉淀法

該方法可重復(fù)性差,，而且磷酸鈣溶液對溫度、pH和緩沖鹽濃度的變化十分敏感,，對細(xì)胞尤其是原代細(xì)胞毒性較大,，也不能采用RPMI培養(yǎng)基，因?yàn)槠浜懈邼舛鹊牧姿猁},。

3,、電穿孔轉(zhuǎn)染法

電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時的小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔,。

當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時可以用電穿孔法轉(zhuǎn)染,。

一般情況下，高電場強(qiáng)度會殺死50%-70% 的細(xì)胞?，F(xiàn)在針對細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑,，可以大大的降低細(xì)胞的死亡率，同時提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率,。

4,、病毒感染

對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與電穿孔轉(zhuǎn)染都無法成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以采用病毒感染，腺病毒,，腺相關(guān)病毒,，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣用于哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率比較高,，適用于較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,。

但是插入的片段長度有一定限制，最重要的是技術(shù)難度比較高,，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及,，而且某些病毒起效時間比較慢，跟不上細(xì)胞這種快速繁殖的速度,，如果只是做簡單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染性價比不高,。

沒有一種方法適用于所有的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)，理想的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇,，如果只是在細(xì)胞水平做,，而且用的是簡單細(xì)胞系，那么脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是綜合比較起來不錯的一個方法。

所以,，我們主要來探討一下脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前,，請先規(guī)劃好你的實(shí)驗(yàn)，一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h,，所以要充分了解細(xì)胞生長速度,，計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量，并確認(rèn)有足夠的下列材料：Opti-MEM無血清培養(yǎng)基,，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑,，以及DNA，這個一定要確認(rèn)好,，否則生氣都沒辦法怪別人,。

做好以上準(zhǔn)備后，具體的操作步驟如下：

1,、細(xì)胞鋪板

(1)一般會選擇復(fù)蘇細(xì)胞傳代3-4次(匯合率達(dá)到90%之前對細(xì)胞進(jìn)行傳代,，不要長到100 %)，從解凍過程中恢復(fù)過來可以穩(wěn)定生長的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,，傳代次數(shù)高(>30-40)時,，細(xì)胞的生長速度和形態(tài)會改變。

(2)如果提總蛋白,，一般選擇六孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染,，因?yàn)檗D(zhuǎn)染的細(xì)胞提取蛋白的總量能達(dá)到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少,。

(3)傳代條件取決于所用的細(xì)胞系,。對于快速生長的細(xì)胞，倍增時間為16小時(如HEK293),。對于生長緩慢的細(xì)胞,，倍增時間為36小時(如原代細(xì)胞)。

(4)轉(zhuǎn)染當(dāng)天,，將細(xì)胞鋪板,。如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降,，如果是簡單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染，可以直接在前一天晚上鋪板,，第二天來轉(zhuǎn)染,。轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞密度會影響轉(zhuǎn)染效率,，細(xì)胞密度保持在匯合率為70-90%(這個前提是轉(zhuǎn)染24h,，如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%)，細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時進(jìn)行,。

2,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基,。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液,，用滅菌后的EP管制備。

以六孔板為例,，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,，分別將A液、B液輕輕混勻,，靜置5min,，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻,，室溫靜置20min,。

加入轉(zhuǎn)染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中，6h后,，更換成**培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體**搭配比例不同，轉(zhuǎn)染前,，應(yīng)該摸一個**配比,。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1，1：1.5,，1：2,，1：2.5，1：3,，1：3.5的梯度比例來檢測**轉(zhuǎn)染比例,，一般質(zhì)粒有帶熒光，可以通過觀察每組熒光強(qiáng)弱來判斷轉(zhuǎn)染效率),。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量,。

轉(zhuǎn)染時，應(yīng)使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒：

1,、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度,，測得的OD值應(yīng)介于1.7-1.9之間。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理,，如果DNA不純,，如帶少量的鹽離子，蛋白,，代謝物污染都會顯zhu影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行,。

2、含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細(xì)胞有很大的毒性作用。

轉(zhuǎn)染時,，小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻,，避免粗暴用力吹打，會導(dǎo)致脂質(zhì)體失效,。

血清一度曾被認(rèn)為會降低轉(zhuǎn)染效率,，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后用PBS洗細(xì)胞然后在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對此敏感的細(xì)胞會受到損傷,，甚至死亡(比如貼壁較差的細(xì)胞,，在PBS洗滌時很容易沖刷細(xì)胞)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。

不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的當(dāng)下,，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說,，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率,，但是血清的存在會影響DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,，在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時需用無血清培養(yǎng)基opti-MEM來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的,。

轉(zhuǎn)染后6小時更換培養(yǎng)基,，因?yàn)閘ipo2000具有一定毒性。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來預(yù)防污染,，但是抗生素可能對轉(zhuǎn)染造成困擾,。比如青霉素和鏈霉素，青鏈霉素是我們常用來預(yù)防污染的抗生素,，就會影響轉(zhuǎn)染,，雖然這些抗生素一般情況下對于真核細(xì)胞無毒，但當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性時,，就會使抗生素也進(jìn)入細(xì)胞從而間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡,，造成轉(zhuǎn)染效率低。

目前轉(zhuǎn)染試劑有些已經(jīng)可以全程都用有血清和抗生素的**培養(yǎng)基來操作,，非常方便,，省去了污染等麻煩。

3,、觀察轉(zhuǎn)染的效果

在轉(zhuǎn)染后24小時,，用熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄熒光蛋白表達(dá)情況，如下圖所示,，說明轉(zhuǎn)染成功,，且轉(zhuǎn)染效率還可以，如果不帶有熒光,，可以用GFP來對照,，可以放在一個單獨(dú)的孔中，或是與目標(biāo)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,，同時用Q-PCR和者WB來檢測,。