陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用,，將DNA分子包裹入內(nèi),，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附,，再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞,。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前實驗室***的轉(zhuǎn)染方法之一,，其轉(zhuǎn)染率較高,，優(yōu)于磷酸鈣法。

2,、磷酸鈣共沉淀法

該方法可重復(fù)性差,，而且磷酸鈣溶液對溫度、pH和緩沖鹽濃度的變化十分敏感,，對細胞尤其是原代細胞毒性較大,，也不能采用RPMI培養(yǎng)基,，因為其含有高濃度的磷酸鹽。

3,、電穿孔轉(zhuǎn)染法

電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的小孔促使DNA分子進入胞內(nèi),，這種方法就是電穿孔。

當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時可以用電穿孔法轉(zhuǎn)染,。

一般情況下,，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。現(xiàn)在針對細胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護劑,，可以大大的降低細胞的死亡率,，同時提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。

4,、病毒感染

對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與電穿孔轉(zhuǎn)染都無法成功轉(zhuǎn)染的細胞系可以采用病毒感染,，腺病毒，腺相關(guān)病毒,，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣用于哺乳動物細胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染,，轉(zhuǎn)染效率比較高，適用于較難轉(zhuǎn)染的細胞,。

但是插入的片段長度有一定限制,，最重要的是技術(shù)難度比較高,，在一般實驗室中很難普及,，而且某些病毒起效時間比較慢，跟不上細胞這種快速繁殖的速度,，如果只是做簡單細胞系的轉(zhuǎn)染性價比不高,。

沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗，理想的方法應(yīng)根據(jù)細胞類型和實驗需要進行選擇,，如果只是在細胞水平做,，而且用的是簡單細胞系，那么脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是綜合比較起來不錯的一個方法,。

所以,，我們主要來探討一下脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：

進行實驗之前，請先規(guī)劃好你的實驗,，一般細胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h,，所以要充分了解細胞生長速度，計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量,，并確認有足夠的下列材料：Opti-MEM無血清培養(yǎng)基,，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑，以及DNA,，這個一定要確認好,，否則生氣都沒辦法怪別人,。

做好以上準備后，具體的操作步驟如下：

1,、細胞鋪板

(1)一般會選擇復(fù)蘇細胞傳代3-4次(匯合率達到90%之前對細胞進行傳代,，不要長到100 %)，從解凍過程中恢復(fù)過來可以穩(wěn)定生長的細胞進行細胞轉(zhuǎn)染,，傳代次數(shù)高(>30-40)時,，細胞的生長速度和形態(tài)會改變。

(2)如果提總蛋白,，一般選擇六孔板進行轉(zhuǎn)染,，因為轉(zhuǎn)染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少,。

(3)傳代條件取決于所用的細胞系,。對于快速生長的細胞，倍增時間為16小時(如HEK293),。對于生長緩慢的細胞,，倍增時間為36小時(如原代細胞)。

(4)轉(zhuǎn)染當(dāng)天,，將細胞鋪板,。如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降,，如果是簡單細胞系的轉(zhuǎn)染,，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來轉(zhuǎn)染,。轉(zhuǎn)染時,，細胞密度會影響轉(zhuǎn)染效率，細胞密度保持在匯合率為70-90%(這個前提是轉(zhuǎn)染24h,，如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%),，細胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時進行。

2,、細胞轉(zhuǎn)染

吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基,。準備轉(zhuǎn)染制備液,，用滅菌后的EP管制備。

以六孔板為例,，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min,，吸取B液加入至A液中,，輕輕混勻，室溫靜置20min,。

加入轉(zhuǎn)染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中,，6h后，更換成**培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體**搭配比例不同,，轉(zhuǎn)染前，應(yīng)該摸一個**配比,。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1,，1：1.5，1：2,，1：2.5,，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測**轉(zhuǎn)染比例,，一般質(zhì)粒有帶熒光,，可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉(zhuǎn)染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量,。

轉(zhuǎn)染時,，應(yīng)使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒：

1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度,，測得的OD值應(yīng)介于1.7-1.9之間,。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理，如果DNA不純,，如帶少量的鹽離子,，蛋白,，代謝物污染都會顯zhu影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行,。

2、含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細胞有很大的毒性作用,。

轉(zhuǎn)染時,，小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻，避免粗暴用力吹打,，會導(dǎo)致脂質(zhì)體失效,。

血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后用PBS洗細胞然后在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染,，但有些對此敏感的細胞會受到損傷,，甚至死亡(比如貼壁較差的細胞，在PBS洗滌時很容易沖刷細胞)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。

不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的當(dāng)下,，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說,，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率,，但是血清的存在會影響DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,，在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時需用無血清培養(yǎng)基opti-MEM來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的,。

轉(zhuǎn)染后6小時更換培養(yǎng)基,，因為lipo2000具有一定毒性。

細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來預(yù)防污染,，但是抗生素可能對轉(zhuǎn)染造成困擾,。比如青霉素和鏈霉素，青鏈霉素是我們常用來預(yù)防污染的抗生素,，就會影響轉(zhuǎn)染,，雖然這些抗生素一般情況下對于真核細胞無毒，但當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑增加了細胞的通透性時,，就會使抗生素也進入細胞從而間接導(dǎo)致細胞死亡,，造成轉(zhuǎn)染效率低。

目前轉(zhuǎn)染試劑有些已經(jīng)可以全程都用有血清和抗生素的**培養(yǎng)基來操作,，非常方便,，省去了污染等麻煩。

3,、觀察轉(zhuǎn)染的效果

在轉(zhuǎn)染后24小時,，用熒光顯微鏡觀察實驗結(jié)果并記錄熒光蛋白表達情況，如下圖所示,，說明轉(zhuǎn)染成功,，且轉(zhuǎn)染效率還可以，如果不帶有熒光,，可以用GFP來對照,，可以放在一個單獨的孔中，或是與目標質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,，同時用Q-PCR和者WB來檢測,。